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福建省HIV-1CRF01_AE流行株的表型分析、基因序列特征、膜蛋白表达及感染性克隆构建的研究

作　者: 黄海龙
导　师: 严延生；颜苹苹
学　校: 福建医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: Ⅰ型艾滋病病毒 生物学表型 CRF01_AE重组型 全长gp120基因 全长基因克隆 序列分析 感染性克隆
分类号: R373
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus,HIV),是逆转录病毒科慢病毒属灵长类慢病毒亚属中的一类病毒。据全国两次分子流行病学调查结果表明HIV CRF01_AE重组型株正在从南部及沿海省市向周围省市扩散,CRF01_AE重组型在全国所占比例也有所增加,在福建省HIV CRF01_AE重组型为主要的流行株。本研究首次在国内开展了HIV CRF01_AE流行株的表型分析、全长膜基因的特征和表达、全长基因的特征和感染性克隆构建的研究,为本型病毒的病原学、变异特征、疫苗、诊断方法和致病机理的研究提供了坚实的基础,本研究分为五个部分。一.福建省HIV-1 CRF01_AE感染者的病毒分离及其生物学表型初步研究1.成功分离4份HIV-1 CRF01_AE感染者的毒株,Fj200604在MT-2细胞诱导了典型的合胞体(SI),另外3个毒株没有形成明显的合胞体(NSI);分离株Fj200601-Fj200603利用CCR5辅助受体,Fj200604利用CXCR4辅助受体。2.分离株的生物学表型与V3环序列变异密切相关,表明通过对V3环关键氨基酸的分析可以预测HIV-1辅助受体的使用情况。二.福建省HIV-1 CRF01_AE亚型毒株全长gp120基因序列特征分析1.基因系统树分析显示本研究所有的样本属于HIV-1 CRF01_AE重组型,遗传变异较大,组内基因距离为9.5±2.5 %。2. V3环顶端四肽存在四种类型:GPGQ(72.24 %),GPGR(19.04 %),GPGH(4.76 %),GQGQ(4.76 %)。16份(76.19 %)样本可能使用CCR5作为辅助受体,1份(4.76 %)样本可能使用CCR5/CXCR4受体,4份样本(19.04 %)不能做出预测。3. C1-C5区比较保守,而V1-V5环变化较大,其中V3相对保守。4. N糖基化位点分析发现大多数位点较为保守,少数糖基化位点发生丢失和增加。三.HIV膜蛋白gp120基因在果蝇S2细胞中的表达1.构建了全长gp120基因和缺失V1/V2环的表达重组载体,在果蝇S2细胞中瞬时表达成功。2.建立了稳定表达的筛选方法,筛选了稳定分泌表达全长gp120基因和缺失V1/V2环的重组果蝇S2细胞。四.福建省13条HIV-1 CRF01_AE亚型毒株全长基因克隆及其序列特征分析1.完成了13株HIV-1 CRF01_AE全基因组克隆,建立了HIV-1 CRF01_AE全基因组扩增平台。2. 13条全基因组克隆测序提交至NCBI(美国国家生物信息数据库)的GenBank。3.系统进化树分析表明所有13条全长基因序列与CRF01_AE参考株聚在一起,但可分成几个亚组分散在泰国分离株中。13条全长基因序列(去除超突变序列Fj061)env,gag,pol三个结构基因区的组内基因离散率均高于泰国分离株;全长基因序列Fj061证实为超突变序列。所克隆序列未出现基因水平的重组,对蛋白酶和逆转录酶的药物依然敏感。五.福建省CRF01_AE重组型感染性克隆的构建和生物学活性初步鉴定1.完成3个全长克隆的连接,293T细胞转染实验表明2个全长克隆(全长克隆A和嵌合全长克隆A-B)显示较好的活性。2.全长克隆A和嵌合全长克隆A-B具有一定程度的感染PBMCs的能力和在PBMCs内进行有效复制的能力,而嵌合全长克隆A-B在PBMCs中的复制能力比全长克隆A更强些。3.嵌合全长克隆A-B应用CCR5作为辅助受体,而全长克隆A未观察到细胞对辅助受体的利用情况。

全文目录


中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
第一部分 福建省HIV-1 感染者的病毒分离及生物学表型初步研究  10-22
  材料和方法  11-17
    1 实验材料  11-12
    2 实验方法  12-17
  结果  17-20
    1 分离毒株的流行病学资料  17
    2 病毒分离结果  17-18
    3 HIV 融合诱导性实验  18
    4 辅助受体利用实验  18-19
    5 V3 环氨基酸序列  19-20
  讨论  20-22
    1 HIV-1CRF01_AE 的分离及生物学表型  20
    2 中国HIV-1 临床分离株的V3 环氨基酸序列分析  20-22
第二部分 福建省HIV-1 CRF01_AE 亚型毒株全长GP120 基因序列特征分析  22-41
  材料和方法  23-30
    1 实验材料  23-25
    2 实验方法  25-30
  结果  30-39
    1 亚型分析情况  30
    2 基因系统进化树和基因距离分析  30-32
    3 V3 环顶端四肽分析  32-33
    4 辅助受体使用预测  33
    5 氨基酸变异分析  33-38
    6 N 糖基化分析  38-39
  讨论  39-41
第三部分 HIV 膜蛋白GP120 在果蝇52 细胞中的表达  41-51
  材料与方法  42-47
    1 实验材料  42
    2 实验方法  42-47
  结果  47-49
    1 全长gp120 和gp120ΔV1/V2 基因的扩增及克隆  47
    2 表达蛋白的检测  47-49
  讨论  49-51
第四部分 福建省13 条HIV-1 CRF01_AE 亚型毒株全长基因克隆及其序列特征分析  51-74
  材料和方法  53-56
    1 实验材料  53-54
    2 实验方法  54-56
  结果  56-70
    1 全长基因分析结果  56-58
    2 近似全长基因或半长基因的扩增结果及酶切鉴定  58-60
    3 全长基因重组分析  60-62
    4 HIV-1 近似全长基因系统进化树和基因距离的分析  62-67
    5 超突变全长序列Fj061 的分析  67-68
    6 V3 环序列分析  68
    7 耐药基因变异分析  68-70
  讨论  70-74
第五部分 福建省CRF01_AE 重组型感染性克隆的构建和生物学活性初步鉴定  74-88
  材料和方法  75-81
    1 实验材料  75-76
    2 实验方法  76-81
  结果  81-84
    1 全长克隆的构建  81
    2 全长克隆转染293T 细胞  81-82
    3 全长克隆感染PBMCs 能力和复制能力的初步研究  82-83
    4 构建感染性克隆的生物学初步研究  83
    5 V3 环序列特征变化  83-84
  讨论  84-88
参考文献  88-95
文献综述  95-123
  1 HIV 病原学  96-102
  2 HIV 的变异  102-109
  3 中国HIV 的流行  109-114
  4 构建福建省HIV-1 流行株全长基因和感染性克隆的背景、目的和意义  114-116
  参考文献  116-123
附录 攻读学位期间发表论文和参加会议情况  123-124
致谢  124

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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