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恶性疟原虫var2csa基因的克隆、表达及免疫识别研究

作　者: 康巍
导　师: 陈启军
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 妊娠相关疟疾恶性疟原虫 var2csa基因 DBL 硫酸软骨素A
分类号: R382.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在疟疾流行地区,孕妇是感染疟疾的高危人群。在撒哈拉以南非洲地区,每年有二千五百万孕妇受到疟疾感染的威胁,妊娠相关疟疾(Pregnancy associated malaria,PAM)已经成为疫源地最为严重的公共卫生安全问题。PAM会导致新生儿低体重(Low birth weight,LBW)、流产、母体贫血。在全球范围内,这一系列严重的并发症每年造成大约75,000—200,000例婴儿死亡。妊娠期间被虫体感染红细胞(Parasitized red blood cells,PRBC)在胎盘的大量聚集是导致该病发病的主要原因。这一聚集现象是由一种独特的恶性疟原虫红细胞表面抗原1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,PfEMP1)与胎盘受体(Chondroitin sulfate A ,CSA)的粘附介导的。研究发现,这一独特的PfEMP1蛋白的编码基因是var2csa,属于var基因家族成员。VAR2CSA是一个350kDa的高分子量蛋白质包含有六个DBL区。高水平的抗VAR2CSA抗体与PAM的保护性免疫有关。至此,基于VAR2CSA用于疫苗的研究,来保护疟疾流行地区的孕妇是可行的。但在目前的技术条件下表达如此之大的一个蛋白质是十分困难的。因此,十分有必要鉴定出哪一个DBL区在粘附过程中发挥主要作用?以及人体对哪一个功能区的免疫应答反应在抗病免疫上起到关键作用?本实验就上述存在的问题进行研究,克隆、表达了六个DBL区重组蛋白质,利用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),将得到的重组蛋白质进行粘附实验和免疫识别实验,对不同DBL区同CSA的亲和能力差异与免疫差异进行了研究。根据不同DBL区的序列设计6对引物,利用PCR技术扩增恶性疟原虫海南株基因组DNA中的六个目的片段,将扩增产物与pMD18-T克隆载体连接。经PCR、酶切、测序鉴定正确后克隆至表达载体pET-22b上,转化至大肠埃希菌BL21 ( DE3 ),以异丙基β-D-硫代半乳糖苷( Isopropyithionβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达重组蛋白,并用亲和层析方法纯化蛋白。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulf polyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blot)检测目的蛋白。结果显示不同组氨酸标签DBL区重组蛋白质分子质量与理论值相符。蛋白质印迹检测结果显示目的蛋白质具有反应原性。利用ELISA方法对六个重组蛋白质与CSA的粘附能力进行检测。用CSA包被ELISA板,四度过夜。将板洗涤三次后,加入3%的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)进行封闭,37℃孵育1h。此后洗板三次,加入梯度稀释的重组蛋白质并在37℃孵育1h。洗板三次,加入5000倍稀释的鼠抗组氨酸标签抗体,37℃孵育1h。洗涤三次,加入20000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体,37℃孵育1h。洗涤三次,加入显色剂显色30分钟,最后测定OD405值。结果显示在任何浓度条件下,DBL5区的OD405都高于其他重组蛋白质,并且达到阴性对照的Sj23的2.1倍。且所有DBL区重组蛋白质的OD405均高于Sj23。这表明,尽管所有DBL区都能与CSA发生粘附,但DBL5区与CSA的粘附能力更强。运用ELISA方法进行不同DBL区的免疫识别实验。实验方法与粘附实验大致相同,但是包被物为重组蛋白质,且用妊娠相关疟疾病人血清和抗人IgG抗体替换了上述实验的重组蛋白和羊抗鼠抗体,并且没有加入抗组氨酸标签抗体。结果经SPSS 17.0统计学软件处理,结果发现,不同DBL区重组蛋白质间P=0.000,P<0.01,不同DBL区重组蛋白质对PAM病人血清中抗体识别的差异影响具有显著意义。其中以DBL5区OD405均值最高,Sj23 OD405均值最低。这表明在PAM抗病免疫过程中,人体对DBL5区的免疫应答可能发挥着关键作用。这一研究结果不仅对基于VAR2CSA的PAM疫苗研发奠定了重要理论基础,而且对于其他基于PfEMP1蛋白质家族的疫苗研发也具有一定意义。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
英文缩写词表  11-12
引言  12-13
第一章文献综述  13-25
  1.1 疟疾与PAM 的危害  13-14
  1.2 恶性疟疾致病机理与细胞粘附  14-15
  1.3 胎盘的病理变化  15-16
  1.4 PAM 的保护性免疫  16-17
  1.5 胎盘受体  17-19
  1.6 var 基因与 PfEMP1  19-20
  1.7 PAM 特异性 PfEMP1—VAR2CSA  20-22
  1.8 PAM 的细胞免疫与致病机理  22-24
  1.9 PAM 的预防与治疗  24-25
第二章研究内容  25-59
  2.1 实验一VAR2CSA 不同DBL 区的克隆、表达、纯化  25-44
    2.1.1 材料  25-26
    2.1.2 主要溶液的配制  26-27
    2.1.3 方法  27-34
    2.1.4 结果  34-43
    2.1.5 讨论  43-44
    2.1.6 小结  44
  2.2 实验二DBL 区重组蛋白质的粘附实验  44-51
    2.2.1 材料  44-46
    2.2.2 方法  46-47
    2.2.3 结果  47-48
    2.2.4 讨论  48-50
    2.2.5 小结  50-51
  2.3 实验三免疫识别实验  51-59
    2.3.1 材料  51-52
    2.3.2 方法  52-53
    2.3.3 结果  53-57
    2.3.4 讨论  57-58
    2.3.5 小结  58-59
结论  59-60
参考文献  60-71
作者简介  71-72
攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果  72-73
致谢  73

恶性疟原虫var2csa基因的克隆、表达及免疫识别研究

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