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研究背景：肾癌占全身恶性肿瘤的3%,为泌尿系肿瘤中发病率仅次于膀胱癌的肿瘤,且放化疗均不敏感。局限性肾癌患者,通过手术治疗可获得痊愈。但约30%的肾癌患者发现肿瘤时已有转移。近年来研究表明在抗肿瘤的细胞免疫中CD8+T细胞(CTLs)起着至关重要的作用,而CTL的激活过程需要抗原递呈细胞(APCs)的参与。树突状细胞(dendritic cells, DC)是功能最强的抗原递呈细胞,用自体的破裂瘤体细胞致敏DC细胞激活细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)可起到免疫作用。本研究通过对肾癌相关抗原G250致敏的DC-CIK共培养细胞对人肾癌细胞的杀伤作用的研究,探讨肾癌免疫治疗的功效。实验方法：1、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的诱导和扩增取人外周全血10ml,用等量PBS稀释,加入10ml淋巴细胞分离液。收集中间层细胞,置37℃、5%CO2培养箱中培养。收集非贴壁的细胞,加入IFN-y,37。C、5%CO2培养,移入经CD3 MeAb10μg/mlx5ml包被过的25ml培养瓶中,用CIK培养液培养,诱导产生CIK细胞。2、树突状细胞(DC)的体外培养取人外周全血10ml,用等量PBS稀释,将10mlFicoll试剂从离心管底部轻轻加入到血的下面。收集淋巴细胞排中间层细胞；置37℃、5%CO2培养箱中培养。收集贴壁细胞的单个核细胞,加入含10%血清的RPM1164,37℃、5%CO2,半定量换液培养。第8天时,可得到DC细胞,继续培养。3、DC-CIK、DC-CIK-G250的体外培养收集培养至成熟的DC以及CIK细胞,加入CIK培养液,收集悬浮细胞,行细胞计数,以DC:CIK=1:4的比例进行混合,再继续用CIK培养液培养,可得DC-CIK。将肾癌相关抗原G250以750ug/L的浓度加入到培养至成熟状态的DC细胞中,,37℃、5%CO2培养,加入CIK培养液,收集悬浮细胞,行细胞计数,以DC:CIK=1:4的比例进行混合,再继续用CIK培养液培养,培养后可得到DC-CIK-G250细胞。4、实验分组及观察指标实验分组为：空白组(A),靶对照组(B),效应对照组(C),实验组(D)。各组分别设3个复孔。各实验组都分别做4个时间点,处理1、3、5、7天,收细胞做用RT-PCR检测细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的表达。培养7d后,收集DC及CIK细胞表型分析。并研究不同的效靶比下,各组细胞对ACHN人肾癌细胞杀伤作用。结果：DC与CIK细胞培养7d后,DC细胞的CD86、CD83表达增加,CD83的表达率为80.3%,CD86为86.4%。CIK细胞CD16+56的表达率为47.4%。随着时间推移,除对照组外IL-2的表达逐渐增加,所有时间点IL-12表达量明显高于其余各组,差异具有统计学意义；第1、3、5天CIK-DC—G250组IL-12表达量明显高于其余各组,差异具有统计学意义；所有时间点CIK-DC—G250组IFN-γ表达量总体高于其余各组,差异具有统计学意义。随着效靶比增加,CIK细胞对ACHN人肾癌细胞杀伤作用增强,效靶比20：1时杀伤作用高于效靶比5：1时(F=2569.29,q=154.47,P<0.01)。在同一效靶比下,DC—CIK组对ACHN细胞的杀伤率则明显高于CIK组(F=2731.15～6982.21,q=35.284～415.3,P<0.01)。DC-ClK-G250组对ACHN细胞的杀伤率明显高于CIK细胞和DC—CIK细胞,效靶比为20：1时,达到90.2%。结论：经肾癌相关抗原G250致敏的DC细胞与CIK细胞共培养后,能提高针对肾癌的免疫作用,能够抑制肾癌细胞。免疫治疗结合药物靶向治疗作为一种新方法,为肾癌的生物治疗奠定了实验基础,用于临床肿瘤治疗前景广阔。
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