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茚地那韦和氯喹协同抑制疟原虫生长研究及减毒疟原虫株的构建

作　者: 李晓芬
导　师: 陈小平
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 茚地那韦氯喹协同抗疟伯氏疟原虫 Rhomboid 1 转染减毒活疟原虫
分类号: R531.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

疟疾流行区常伴随着高频率的人免疫缺陷病毒(HIV-1)的感染。在疟原虫和HIV-1共感染人群中,各自化疗药物之间的相互作用可能对疾病的治疗结果产生影响。我们前期实验证明许多逆转录病毒蛋白酶抑制剂在体外可以有效抑制人恶性疟原虫的生长。因此,有研究报道逆转录病毒蛋白酶抑制剂和抗疟药之间相互作用对疟疾和/或艾滋病的治疗有影响。本研究中,我们分别在体外和体内模型上,对逆转录病毒蛋白酶抑制剂——茚地那韦和氯喹在氯喹抗性株和氯喹敏感株中的相互作用进行了研究。在体外,我们采用SYBR Green I的荧光定量法来检测药物的抗疟活性,用等效线分析法检测药物之间的相互作用。结果显示茚地那韦和氯喹在体外无论是对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)药物敏感株3D7还是多药耐药株Dd2都表现出协同的作用。进而,我们研究了茚地那韦和氯喹在小鼠感染模型上的协同作用。NIH雌性小鼠(~25g)腹腔接种夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)敏感株ASS或抗性株ASCQ感染的红细胞,接种后第4, 24, 48, 72小时口服给药。实验组包括对照组,不同剂量氯喹单独组,不同剂量茚地那韦单独组,氯喹和茚地那韦不同浓度比例的联合组。第四天,血涂片检测感染率,结果表明茚地那韦和氯喹对两种虫株的生长都表现出协同抑制作用,这种协同效应在抗性株中更为明显。我们进一步研究了这两个药物的联合对小鼠转阴率的影响。72只小鼠随机分成6组(每组12只),腹腔接种2×107感染夏氏疟原虫抗性株ASCQ的红细胞。接种后第三天口服给药,第一组每天10mg/kg的氯喹连续给药4天。第2~5组,每组每天10mg/kg的氯喹联合不同剂量的茚地那韦(0.3,0.6,1.2,1.8 g/kg)连续给药4天。第6组每天100mg/kg的氯喹连续给药4天。接种后第三天开始,每天血涂片直到第九天。结果表明两种药物在合适的剂量搭配时可以100%清除抗性株且无明显的毒性。结果提示我们茚地那韦和氯喹的联合可作为一种新型的抗疟药复方。疟疾仍然威胁着人类的健康。研制安全、价廉和有效的疟疾疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途径。最理想的疟疾疫苗是减毒全虫活疫苗。目前常用的手段是对疟原虫进行基因修饰以达到减毒目的。所以,疟原虫基因工程的研究变得越来越重要。目前,这方面的研究也取得了很大的成果。在我们的实验中,我们在鼠感染模型上对伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)进行基因修饰从而获得基因修饰后的疟原虫减毒并同时表达MUC1蛋白。我们将含有P. berghei毒性相关基因Rhomboid 1的同源序列和MUC1表达序列的质粒转染伯氏疟原虫,使疟原虫减毒并同时表达MUC1蛋白。免疫印迹检测MUC1的表达,位点特异性PCR检测插入位点是否正确,RT-PCR检测Rhomboid 1是否失活,有限稀释法进行虫株的单克隆化。结果显示MUC1蛋白可以在疟原虫体内表达,但是我们没有得到减毒的疟原虫株。Rhomboid是个基因家族,疟原虫生长缓慢这一表型是ROM1失活特异性的,所以我们推测所用转染质粒可能插入到Rhomboid基因家族的其他基因上了。

茚地那韦和氯喹协同抑制疟原虫生长研究及减毒疟原虫株的构建

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