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杆状病毒介导的丙肝病毒可感染体外细胞培养体系的建立

作　者: 姚相杰
导　师: 陈新文
学　校: 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）
专　业: 微生物学
关键词: HCV 杆状病毒感染性细胞培养体系 NS2 X启动子
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是引起输血后及散在性的非甲非乙型肝炎(Non-A, Non-B Hepatitis, NANBH)主要病原体，世界上有超过1.7亿的HCV慢性感染者。HCV的感染已经成为一个世界性的医疗问题。缺乏稳定可靠的扩增HCV的体外细胞培养体系和动物模型曾长期阻碍HCV的研究和抗病毒药物的筛选。随着近年来HCV2a(JFH1)和相关嵌合型感染性克隆株cDNA的构建，这一状况有所改善。杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，作为生物杀虫剂广泛应用于害虫防治。随着分子水平的基础研究迅猛发展，杆状病毒作为一种新型的基因转移载体受到人们的高度重视。本文把杆状病毒载体应用于HCV体外细胞培养体系的建立中。通过杆状病毒载体的介导把HCV JFH1亚型的全基因组cDNA导入敏感细胞Huh7-lunetT7中，在该细胞内稳定表达的T7RNA聚合酶的帮助下实现HCV基因组的转录和表达，从而建立一种新的HCV体外细胞培养体系。第一章以综述的形式介绍了HCV的病毒学特点和研究现状，系统回顾了HCV体外细胞培养体系的建立发展过程及存在的问题；同时介绍了杆状病毒的特点和作为基因转移载体在HCV研究中的应用。第二章主要研究了利用杆状病毒AcMNPV做载体在肝癌细胞中表达HCV基因组的情况。首先构建了含有HCVJFH1亚型全基因组cDNA的重组杆状病毒vAcJFH1和对照病毒vAcJFH1(GND)，建立了稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系Huh7-lunetT7。然后把含有HCVJFH1全基因组的重组杆状病毒转导Huh7-lunetT7细胞来实现HCV全基因组的表达。RT-PCR、链特异性RT-PCR的检测结果显示在被转导的Huh7-lunetT7细胞内有HCV正负链的合成，而Real-time RT-PCR的结果则表明转导细胞的上清中HCV的基因拷贝数可以达到10~7拷贝／mL，而且HCV基因组拷贝数的增加和对照相比是一个动态变化过程，先逐步升高，当细胞密度太大的时候略有下降。Western-blot和免疫荧光分析表明HCV结构蛋白E2在转导后24h开始表达，NS5B蛋白在转导后12h开始表达，而且主要在细胞质中呈点状分布。电镜、免疫电镜显示在转导的细胞上清中可以检测到直径55nm左右的HCV病毒颗粒。蔗糖密度梯度离心则进一步证明这些HCV病毒颗粒存在于1.08-1.10克／mL的浮力密度梯度范围内。第三章进一步对一次转导产生的HCV病毒体的感染性进行了分析。把一次转导细胞的上清过滤后感染HCV敏感细胞系Huh7-lunet CD81，结果在被感染细胞内不仅检测到了HCV正负链的合成，还检测到了HCVE2蛋白的表达。这表明利用杆状病毒载体产生的HCV病毒体具有自然感染性，可以感染敏感细胞系Huh7-lunet CD81，并能在其中复制产生HCV负链RNA中间体和合成病毒蛋白。第四章则研究了HCV／HBV混合感染中的相互作用，特别是HCV蛋白对HBV启动子的调控作用。结果表明，HCV的NS2蛋白可以激活HBVX启动子的活性。论文首次利用杆状病毒载体系统在肝癌细胞中建立了一种可感染性的HCV体外细胞培养体系，在该体系中不仅能检测到HCV病毒颗粒的存在，而且能检测到HCV的复制。此外该体系利用T7启动子而非CMV启动子去实现HCV基因组在细胞质中的表达，转录产物5’端不加帽，不入核，更贴近HCV自然发生过程。该体系的建立为研究HCV的致病机理和疫苗研制、抗病毒药物筛选提供了一种新的平台。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一章引言  9-33
  1 丙肝病毒简介  9-14
  2 HCV复制感染细胞培养体系的建立  14-22
  3 HCV感染的动物模型  22-24
  4 杆状病毒载体应用的研究  24-28
  5 杆状病毒载体在HCV研究中的应用  28-31
  6 本论文研究的内容和意义  31-33
第二章杆状病毒介导的HCVJFH1基因组在肝癌细胞中的表达  33-60
  摘要  33-34
  1 引言  34-35
  2 材料和方法  35-48
  3 结果  48-57
  4 讨论  57-60
第三章杆状病毒载体介导产生的HCV病毒体的感染性的验证  60-65
  摘要  60-61
  1 引言  61
  2 材料和方法  61-62
  3 结果  62-64
  4 讨论  64-65
第四章丙肝病毒和乙肝病毒混合感染中丙肝病毒蛋白对乙肝病毒启动子的调控  65-73
  摘要  65-66
  1 引言  66-67
  2 材料与方法  67-68
  3 结果  68-71
  4 讨论  71-73
第五章总结  73-74
参考文献  74-83
发表文章目录  83-84
致谢  84-85

杆状病毒介导的丙肝病毒可感染体外细胞培养体系的建立

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