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人源ADP核糖焦磷酸水解酶结构与功能的研究

作　者: 查满武
导　师: 丁建平
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 结晶学 X-射线晶体结构 ADP核糖焦磷酸水解酶 Nudix家族酶动力学催化反应机理模型
分类号: Q55
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

ADP-核糖(ADPR)是NAD+,环形ADP-核糖和聚ADP-核糖的酶催化代谢物。细胞内高水平的ADP-核糖使体内蛋白质产生非催化型的ADP-核糖化,从而导致蛋白质功能的失活,此外高水平的ADPR还会干扰正常ADPR依赖型酶的生理功能。ADP-核糖焦磷酸水解酶属于Nudix水解酶家族,这是一类催化与残基X相连的二磷酸核苷的水解酶类,Nudix家族蛋白质含有保守序列GX5EX7REUXEEXGU,这些保守氨基酸在Nudix水解酶中参与催化位点的形成。人源ADP核糖焦磷酸水解酶(hNUDT5)催化水解ADP-核糖,生成AMP和5-磷酸核糖。本研究从人CD34+造血干细胞中克隆出hNUDT5基因,通过晶体学和X衍射的方法得到该蛋白的四种三维结构:①apo全酶分子结构;②底物ADPR和蛋白二元复合物结构;③产物AMP、金属离子和蛋白三元复合物结构;④底物类似物AMPCPR、金属离子和蛋白三元复合物结构。对该蛋白各种三维结构之间差异的比较分析,揭示出该蛋白结合底物ADPR选择特异性的分子机制。研究表明,hNUDT5是以二聚体形式发挥功效,一个亚基的N端结构域和另一个亚基的C端结构域形成底物结合口袋,二聚体的两个结合口袋具有等效生物活性,底物ADPR通过与底物结合口袋周围侧链氨基酸的相互作用而被识别。hNUDT5一个亚基的TRP28和另一个亚基的TRP46能够识别底物ADPR分子的嘌呤环,它们三者之间可形成强的π-π堆积,这是该蛋白选择结合的底物大多数为ADP-糖类的关键。通过与大肠杆菌中Orf209和Orf186这两种ADP核糖焦磷酸水解酶结构的比较,揭示出该类蛋白L8 Loop上的芳香族氨基酸对底物APnA的识别至关重要。通过与另一人源ADP核糖焦磷酸水解酶(hNUDT9)结构的比较,阐明了hNUDT5对底物O-acetyl-ADPRs有水解活性,而hNUDT9对底物O-acetyl-ADPRs无水解活性的分子基础。在上述结构研究的基础上,将hNUDT5活性中心周围的重要氨基酸分为两类:一类氨基酸与底物ADPR的结合相关;另一类氨基酸与金属离子的结合及生化活性相关。通过测定hNUDT5突变体酶学常数Km值和kcat值的变化,阐明了这些氨基酸在催化过程中的作用。基于所测定的底物类似物、金属离子和蛋白三元复合物过渡态结构,提出了hNUDT5的催化反应机理模型,为同类酶进一步的功能研究提供了结构基础和理论依据。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1. 引言  10-26
  1.1 Nudix 水解酶超家族概况  10-18
    1.1.1 大肠杆菌Nudix 水解酶  11-14
    1.1.2 人源Nudix 水解酶  14-18
  1.2 ADP 核糖焦磷酸水解酶亚家族概况  18-19
  1.3 ADP 核糖焦磷酸水解酶亚家族的晶体结构  19-23
    1.3.1 大肠杆菌ADP-Ribose 焦磷酸水解酶的晶体结构  19-22
    1.3.2 人源ADP-Ribose 焦磷酸水解酶的晶体结构  22-23
  1.4 ADP 核糖焦磷酸水解酶亚家族的催化反应机理  23-25
  1.5 人源ADP 核糖焦磷酸水解酶的研究进展  25-26
2. 材料和方法  26-39
  2.1 材料和试剂  26-28
    2.1.1 常用试剂和材料  26
    2.1.2 菌株  26
    2.1.3 仪器  26-28
  2.2 方法  28-39
    2.2.1 hNUDT5基因的克隆、表达载体和菌株构建  28
    2.2.2 ΔhNUDT5突变体的构建  28-29
    2.2.3 hNUDT5的表达和纯化  29-32
      2.2.3.1 全长hNUDT5 N端6HIS tag的融合蛋白的表达纯化  29
      2.2.3.2 C末端9氨基酸切除型的表达纯化  29-30
      2.2.3.3 硒代甲硫氨酸取代的ΔhNUDT5的表达纯化  30-32
      2.2.3.4 ΔhNUDT5（肽段1-210）突变体的表达纯化  32
    2.2.4 蛋白质浓度测定方法  32
    2.2.5 蛋白质纯度鉴定和浓缩  32
    2.2.6 溶液中蛋白质分子尺寸和聚集状态分析  32-33
    2.2.7 晶体生长－悬滴气相扩散法  33-36
      2.2.7.1 结晶条件筛选  33
      2.2.7.2 全长hNUDT5 N端6HIS tag融合蛋白晶体的生长和优化  33
      2.2.7.3 ΔhNUDT5和底物ADPR二元复合物晶体的生长和优化  33-34
      2.2.7.4 ΔhNUDT5和产物AMP及R5P复合物晶体的生长和优化  34
      2.2.7.5 ΔhNUDT5和产物AMP及Mg三元复合物晶体2  34
      2.2.7.6 ΔhNUDT5和底物类似物AMPCPR及Mg三元复合物晶体2  34-35
      2.2.7.7 硒代ΔhNUDT5晶体的生长和优化  35-36
    2.2.8 X-射线晶体衍射和数据处理  36-37
      2.2.8.1 晶体的低温流冷冻保护（cryo cooli  36
      2.2.8.2 数据收集和处理  36-37
    2.2.9 结构解析  37-38
      2.2.9.1 多波长反常散射法解析相位  37
      2.2.9.2 初始模型的建立和结构精修  37-38
        2.2.9.2.1 初始模型的建立  37
        2.2.9.2.2 结构精修  37-38
    2.2.10 hNUDT5 酶活力的检测  38-39
3. 结果  39-62
  3.1 全长hNUDT5 的表达、纯化和结晶  39-41
  3.2 ΔhNUDT5 截短体的克隆表达、纯化和结晶  41-46
  3.3 hNUDT5 各种晶体的结构解析  46-60
    3.3.1 全长hNUDT5 apo形式晶体的结构  49-51
    3.3.2 ΔhNUDT5和底物ADPR二元复合物晶体的结构  51-54
    3.3.3 ΔhNUDT5和产物AMP及Mg三元复合物晶体的结构2  54-56
    3.3.4 ΔhNUDT5和底物类似物AMPCPR及Mg三元复合物晶体的结构2  56-60
  3.4 hNUDT5 酶活力的检测  60-62
4. 讨论  62-73
  4.1 hNUDT5 和大肠杆菌 ADP 核糖焦磷酸水解酶的比较  62-66
  4.2 hNUDT5 和 hNUDT9 的比较  66-68
  4.3 ΔhNUDT5 突变体的动力学研究  68-71
    4.3.1 和底物嘌呤环识别相关氨基酸突变体的影响  68-69
    4.3.2 和底物磷酸分子和核糖残基结合相关氨基酸突变体的影响  69-70
    4.3.3 和底物活性相关氨基酸突变体的影响  70-71
  4.4 hNUDT5 的催化反应机理模型  71-73
5. 结论  73-74
参考文献  74-86
蛋白数据库入口 PDB 号  86-87
附表  87-88
发表文章目录  88-89
致谢  89-90

人源ADP核糖焦磷酸水解酶结构与功能的研究

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