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人心肌肌钙蛋白I的几种检测方法及其应用研究

作　者: 郭会时
导　师: 何农跃；张寄南
学　校: 东南大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 急性心肌梗死(AMI) 心肌肌钙蛋白I(cTnI) 胶体金 银增强 蛋白芯片 电化学免疫分析法(ECIA) 介孔材料 碳糊修饰电极 阳极溶出伏安法 化学发光免疫分析法 碱性磷酸酶
分类号: R446.6
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


心肌肌钙蛋白I（cTnI）是组成心肌肌钙蛋白复合物的亚单位之一，具有高度的心肌特异性，被认为是诊断心肌损伤的“金标准”。快速、灵敏、准确测定人血中的cTnI对于诊断急性心肌梗死、急性冠状动脉综合征的危险分层、监测各种因素所导致的心肌损伤、以及心脏事件的判断预后等有着重要的意义。 目前，测定cTnI的方法主要有放射性同位素免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、化学发光免疫分析法（CLIA）、荧光免疫分析法（FIA）、以及金标免疫分析法等。其中，RIA法因有放射性污染的危险已基本不使用；CLIA法和FIA法灵敏度较高，但仪器价格偏高，国内在这方面的研究相对较少；金标免疫分析法主要应用于制作定性分析用的免疫层析试纸条，现在国内各医院多使用国外公司的产品，价格昂贵，国内学者虽在这方面有不少研究，但其灵敏度不高，难以推向市场；目前国内研究和应用最多的方法是ELISA，该方法灵敏度适中，使用相对简便，仪器价格也不很高，但存在测定周期偏长、灵敏度相对较低、检测范围较窄等不足。 考虑到检测人血液中cTnI对于判断心肌损伤的重要性，以及目前国内测定cTnI的方法所存在的这样或那样的缺陷，本论文从快速、灵敏、准确测定和降低检测成本等方面入手，综合应用纳米金标记技术、纳米孔材料上的生物分子固定化技术、以及高灵敏的电化学检测技术和化学发光检测技术，建立了几种测定人cTnI的方法，弥补了现有方法的某些不足。具体内容如下： 1．金标银染法快速检测人血清中cTnI的研究 纳米金具有特殊的光学和电学性质，生物相容性好，是继放射性同位素、酶、发光（荧光）物质之后的又一种卓越的免疫标记物质，银染技术的引进使其可见性得以显著提高，从而使免疫检测的灵敏度随之大幅度提高。本文以硝酸纤维膜作为基底，结合一步法双单克隆抗体夹心技术、低密度蛋白芯片技术、纳米金探针技术、以及纳米金颗粒上的银染放大技术建立了一种检测人心肌肌钙蛋白I的快速测定法。方法具有极高的特异性，当血清样品中心肌肌钙蛋白T（cTnT）、肌红蛋白（Mb）、以及骨骼肌肌钙蛋白I（sTnI）的浓度分别高达0.2 μg／mL、100 μg／mL、以及30 μg／mL时，仍然不干扰cTnI的测定和判断；检测速度快，能在40分钟内报告测定结果；耗样量少，一次测定只需要10 μL血清样本；方法重复性好，同一样品在同一块基片上的测定结果的批内变异系数（n=8）以及不同时间在不同基片上的测定结果的批间变异系数（n=8）均小于20％；通过对200例正常人血清标本的测定获得了该方法的临界值（CUT-OFF）为0.3 ng／mL，以此临界值作为判断依据测定了588例病人血清中的cTnI含量，同时与ELISA法的测定结果进行比较（采用SPSS 11.0统计分析软件），显示两种方法的测定结果间差异不具有显著性意义（P=0.66；一般认为当P＞0.05时，两种方法之间的差异不具有显著性意义），由两种方法判断所得结果的符合率为86％。 2．测定人cTnI的阳极溶出伏安法研究 介孔分子筛具有比表面积大、孔径与生物分子尺寸相当、表面基团丰富并易功能化和孔道结构规则有序等独特的优点，是制作化学修饰电极、固定生物活性分子的理想材料。本文首次以分子筛作为修饰剂制备碳糊修饰电极用于固定抗体分子，并以该修饰电极结合抗原抗体的双抗体夹心反应、纳米金标记抗体技术、纳米金上的银增强技术、以及阳极溶出伏安法等方法和技术，建立了一种测定人血清中cTnI的电化学免疫分析新方法，并进行了其应用的可行性分析。实验表明，在分子筛修饰制备的修饰电极上相对于纯碳糊电极上阳极溶出峰电流信号有显著增强，在SBA-15（孔径9.19 nm）修饰碳糊电极（SBA-MCPE）、MCM-41（孔径3.10 nm）修饰碳糊电极（MCM-MCPE）、Y型分子筛（孔径0.74 nm）修饰碳糊电极（Y-MCPE）、以及未经修饰处理的纯碳糊电极（CPE）上的峰电流比值约为10∶7∶2∶1，显示分子筛对抗体分子的固定能力与分子筛的孔径正相关；采用单因素变化法优化了实验条件，银的阳极溶出峰电流信号与血清中cTnI的浓度在0.5～5.0 ng／mL的范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为：Ip（μA）=1.0+3.5 C（ng／mL），相关系数R2=0.98，方法检出限为0.2 ng／mL：对实际样品的测定结果与ELISA法的测定结果基本吻合。 3．化学发光酶免疫分析法检测人血清中cTnI的研究 化学发光免疫分析法（CLIA）是一种高灵敏度的免疫分析法，其检测灵敏度可与RIA法相媲美。本文在传统的ELISA法的基础上，在进行免疫反应后，改用高效的化学发光试剂3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基4-（3”-羟基）苯-1，2-二氧杂环丁烷磷酸（AMPPD）作为检测底物，并且将传统的两步双抗夹心法改为一步法进行免疫反应，建立了一种高灵敏度的测定人血清中cTnI的化学发光酶免疫分析法。采用单因素变化法和方阵滴定法得到的最佳实验条件为：捕获抗体包被浓度选择10 μg／mL，选择pH 7.0的PBS作为免疫反应缓冲底液，以含1％ BSA的pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃封闭过夜，生物素-检测抗体（Biotin-IgG2）以及碱性磷酸酶-亲和素（ALP-Avidin）结合物的稀释度均采用1∶2000，免疫反应条件为37℃孵育60 min，以去离子水作为洗涤剂，以1∶100稀释的AMPPD作为发光反应底物，选择发光反应时间为10 min（37℃）。方法充分发挥了化学发光法的高灵敏度检测优势，具有很高的灵敏度，检出限为0.02 ng／mL，比传统的ELISA法检测限降低一个数量级以上；检测速度较快，整个测定周期约75 min，比传统的两步法ELISA快得多；检测范围宽（0.04～36.2 ng／mL），比传统ELISA法扩宽了近两个数量级；方法准确可靠，加标试验回收率介于97.5％～102.8％之间，对实际样品的测定结果与ELISA法的测定结果相吻合；重复性好，三个样品的批内变异系数均小于8.5％（n=12），批间平均变异系数小于15％（n=8）。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-15
第一章 绪论  15-41
  §1.1 辅助诊断急性心肌梗死的常用生化指标  15-23
    1.1.1 肌酸激酶及其同工酶  15-16
      1.1.1.1 肌酸激酶(CK)  15-16
      1.1.1.2 肌酸激酶同工酶(CK-MB)  16
    1.1.2 乳酸脱氢酶及其同工酶  16-17
      1.1.2.1 乳酸脱氢酶(LDH)  16
      1.1.2.2 乳酸脱氢酶同工酶  16-17
    1.1.3 肌红蛋白和碳酸酐酶  17-18
      1.1.3.1 肌红蛋白(Mb)  17
      1.1.3.2 肌红蛋白/碳酸酐酶比值(Mb/CAⅢ)  17-18
    1.1.4 心肌型脂肪酸结合蛋白  18
    1.1.5 糖原磷酸化酶BB  18
    1.1.6 超敏C-反应蛋白  18-19
    1.1.7 心肌肌钙蛋白  19-22
      1.1.7.1 心肌肌钙蛋白T(cTnT)  20
      1.1.7.2 心肌肌钙蛋白I(cTnI)  20-22
    1.1.8 其它  22-23
  §1.2 心肌肌钙蛋白I的测定方法和临床意义  23-32
    1.2.1 测定方法  24-28
      1.2.1.1 放射免疫法(RIA)  24
      1.2.1.2 酶联免疫吸附试验法(ELISA)  24-25
      1.2.1.3 化学发光法  25
      1.2.1.4 荧光分析法  25-26
      1.2.1.5 金标免疫法  26-28
    1.2.2 临床应用  28-32
      1.2.2.1 急性心肌梗死的诊断、预后和危险分层  28-29
      1.2.2.2 估计心肌梗死面积  29
      1.2.2.3 判断溶栓疗效  29
      1.2.2.4 监测心脏手术造成的心肌损伤  29-30
      1.2.2.5 对病毒性心肌炎的诊断  30
      1.2.2.6 其它  30-32
  §1.3 本论文研究思路和主要内容  32-33
  参考文献  33-41
第二章 金标银染法快速检测人血清中cTnI的研究  41-68
  §2.1 引言  41-47
    2.1.1 蛋白质芯片技术及其应用  41-44
      2.1.1.1 蛋白质芯片的制备  41-43
      2.1.1.2 蛋白质芯片的特点  43
      2.1.1.3 蛋白质芯片的应用  43-44
    2.1.2 胶体金及其在生物检测中的应用  44-47
      2.1.2.1 胶体金的结构  44
      2.1.2.2 胶体金的特性  44-45
      2.1.2.3 胶体金的制备方法  45-46
      2.1.2.4 胶体金在生物学研究中的应用  46-47
  §2.2 实验部分  47-50
    2.2.1 标本来源  47
    2.2.2 主要试剂和材料  47
    2.2.3 仪器  47-48
    2.2.4 免疫金探针的制备  48
    2.2.5 膜基片的制备  48
    2.2.6 测定过程  48-50
  §2.3 结果和讨论  50-65
    2.3.1 免疫金探针的鉴定  50-53
      2.3.1.1 透射电子显微成像技术  50-51
      2.3.1.2 红外光谱  51-52
      2.3.1.3 可见吸收光谱  52
      2.3.1.4 免疫金颗粒浓度的测定  52-53
    2.3.2 条件试验  53-61
      2.3.2.1 影响免疫金探针性能的因素  53-57
      2.3.2.2 影响膜基片性能的因素  57-59
      2.3.2.3 影响免疫反应的因素  59-60
      2.3.2.4 银染条件的选择  60-61
    2.3.3 分析应用  61-65
      2.3.3.1 特异性和敏感性  61-63
      2.3.3.2 重复性  63-64
      2.3.3.3 样品测定  64-65
  §2.4 结论  65-66
  参考文献  66-68
第三章 测定人cTnI的阳极溶出伏安法研究  68-91
  §3.1 引言  68-74
    3.1.1 电化学免疫分析法及其应用  68-72
      3.1.1.1 生物分子固定化技术  68-71
      3.1.1.2 标记物  71
      3.1.1.3 免疫分析方法  71-72
      3.1.1.4 电化学测定方法  72
    3.1.2 硅基分子筛及其在生物分子检测中的应用  72-74
  §3.2 材料与方法  74-77
    3.2.1 实验材料  74
    3.2.2 分子筛的合成和表征  74-75
    3.2.3 碳糊修饰电极的制备  75-76
    3.2.4 实验方法  76-77
  §3.3 结果与讨论  77-88
    3.3.1 银在SBA-15修饰碳糊电极(SBA-MCPE)上的循环伏安信号及起始扫描电位的选择  77-78
    3.3.2 cTnI在碳糊修饰电极上的响应信号及修饰的选择  78-80
    3.3.3 条件试验  80-87
      3.3.3.1 修饰电极中SBA-15修饰比例的选择  80-81
      3.3.3.2 粘合剂比例的选择  81
      3.3.3.3 反应体系pH的选择  81-82
      3.3.3.4 捕获抗体浓度和结合时间的选择  82-83
      3.3.3.5 封闭剂和封闭时间的选择  83
      3.3.3.6 抗原反应时间的选择  83-84
      3.3.3.7 金标检测抗体浓度和反应时间的选择  84-85
      3.3.3.8 银染时间的选择  85-86
      3.3.3.9 电极的重复使用性  86-87
      3.3.3.10 线性范围和检出限  87
    3.3.4 样品测定  87-88
  §3.4 结论  88-89
  参考文献  89-91
第四章 化学发光酶免疫分析法检测人血清中cTnI的研究  91-111
  §4.1 引言  91-96
    4.1.1 化学发光免疫分析基本原理  91-93
      4.1.1.1 化学发光基本原理  91-92
      4.1.1.2 化学发光免疫分析基本原理  92
      4.1.1.3 化学发光免疫分析中常用化学发光试剂  92-93
    4.1.2 化学发光免疫分析基本类型  93-96
      4.1.2.1 标记化学发光物质的化学发光免疫分析  93-94
      4.1.2.2 化学发光酶免疫分析  94-95
      4.1.2.3 电化学发光免疫分析  95-96
  §4.2 材料与方法  96-97
    4.2.1 实验材料  96
    4.2.2 生物素-检测抗体(Biotin-IgG_2)复合物的制备  96
    4.2.3 实验方法  96-97
  §4.3 结果与讨论  97-108
    4.3.1 捕获抗体包被浓度的选择  97-98
    4.3.2 板孔表面的封闭处理  98
    4.3.3 免疫反应体系pH的选择  98-99
    4.3.4 免疫反应体系中Biotin-IgG2及ALP-Avidin稀释度的选择  99-101
    4.3.5 免疫反应时间的选择  101-102
    4.3.6 洗涤方式的选择  102-103
    4.3.7 发光底物稀释度的选择  103-104
    4.3.8 发光反应时间的选择  104
    4.3.9 国产微孔板与进口微孔板比较  104-105
    4.3.10 检测范围和检出限  105-106
    4.3.11 回收率  106
    4.3.12 重复性  106-107
    4.3.13 样品测定  107-108
  §4.4 结论  108-109
  参考文献  109-111
第五章 总结和展望  111-113
  §5.1 论文工作的主要内容和研究结果  111-112
  §5.2 下一步工作需要解决的问题  112-113
附录  113-116
致谢  116-117
优秀博士学位论文推荐表  117-119
作者简况表  119-120
指导教师简况表  120

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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