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植物内生菌生物活性物质的研究

作　者: 阮丽军
导　师: 朱宝泉
学　校: 上海医药工业研究院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 植物内生菌 筛选 分离纯化 次级代谢产物 HIV-1整合酶抑制剂 抗肿瘤活性 细胞凋亡 分子机制
分类号: R91
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


植物内生菌作为一个多样性十分丰富的微生物类群，代谢产物非常丰富，包括杀虫、抗菌、抗肿瘤等活性物质，是人们寻找新型抗菌、抗肿瘤药物的重要资源。本论文利用上海来益生物药物研发中心的植物内生菌资源，通过各种模型的筛选，在获得活性菌株的基础上，对其中的三株进行了菌种鉴定，并对它们的次级代谢产物进行分离、纯化及活性研究。主要研究工作包括以下几个方面： 利用770株植物内生菌进行了发酵液的样品制各，获得了7040份样品，经14种不同模型筛选，共获得16份活性样品。对具有HIV-1整合酶抑制剂活性的菌株HCCB00167、HCCB00189及具有抗肿瘤活性的菌株HCCB00189、HCCB01546进行进一步的研究。 根据菌株的形态、培养特征及18S rDNA序列分析结果，活性菌株HCCB00167、HCCB00189及HCCB01546进行菌种鉴定，分别鉴定为蚀丝霉属、枝顶孢霉属、白壳菌属。 对活性菌株HCCB00167、HCCB00189及HCCB01546进行了代谢产物的研究。应用多种分离方法，从菌株HCCB00167的发酵液中分离出七个化合物：HCCB00167-1～7。鉴定了其中6个化合物，分别为：5，8-过氧麦角甾-6，22-二烯-3-醇；麦角甾醇；3，22，24-三羟基-齐果墩烷-12-烯；4’-羟基，7-甲氧基异黄酮；4’，5-二羟基，7-甲氧基异黄酮；4-丁基-2-吡啶羧酸。其中化合物HCCB00167-7为首次直接从微生物来源的代谢产物中获得。 从菌株HCCB00189的发酵液中分离出五个化合物：HCCB00189-1～5。分别鉴定为：4-甲基苯甲酸羧甲基酯；4-甲氧甲酰基苯甲酸；4-羟甲基苯甲酸；4’，7-二羟基异黄酮，即大豆甙元；4’，5，7-三羟基异黄酮，即染料木素。其中HCCB00189-1、2、3三个化合物为首次从微生物来源的代谢产物中分离得到。并对五个化合物进行抗肿瘤活性测试，结果显示：化合物HCCB00189-4与HCCB00189-5对A549和LoVo细胞有较明显的抗肿瘤活性。 从菌株HCCB01546的发酵液中分离出六个化合物：HCCB01546-A-F。运用现代波谱技术，鉴定了其中5个化合物，分别为：麦角甾醇、过氧化麦角甾醇、环氧化细胞松驰素H、细胞松驰素N和环氧化细胞松驰素J。其中HCCB01546-C、D、E三个化合物为首次从白壳菌属中分离得到的细胞松驰素类物质。通过体外抗肿瘤活性测试发现化合物HCCB01546-B、HCCB01546-C及HCCB01546-E对肿瘤细胞A549和(或)LoVo细胞有较明显的抑制作用。 MTT法考察了化合物HCCB01546-C对多种肿瘤细胞的抑制作用，发现其抗肿瘤活性呈明显的剂量效应和时间效应关系，而肝癌Hep-G2细胞对化合物HCCB01546-C有明显耐受。体内移植瘤实验结果表明，化合物HCCB01546-C对裸鼠移植瘤的生长有明显的抑制作用，且均有一定的量效关系。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩写  11-12
第1章 绪论  12-35
  1.1 植物内生菌的研究概况  12-17
    1.1.1 植物内生菌的定义及内生真菌的生态类群  12-14
    1.1.2 植物内生真菌的多样性  14-15
    1.1.3 植物内生菌与宿主植物之间的关系及其相互间的关系  15
    1.1.4 植物内生菌的作用  15-17
  1.2 药用植物内生真菌资源的研究现状  17-21
    1.2.1 红豆杉内生真菌的研究  17-19
    1.2.2 长春花、桃儿七药用植物内生真菌的研究  19-20
    1.2.3 其它药用植物内生真菌的研究  20-21
  1.3 植物内生菌产生活性代谢产物的理论研究  21-22
    1.3.1 生物间的“基因水平传递”及“内共生理论”  21
    1.3.2 生物之间的相互作用和“协同进化”  21-22
  1.4 植物内生真菌产生的活性代谢产物研究进展  22-31
    1.4.1 抗肿瘤活性物质  22-24
    1.4.2 抗菌类活性物质  24-28
    1.4.3 杀虫类活性物质  28
    1.4.4 植物生长调节物质  28-29
    1.4.5 免疫抑制剂  29
    1.4.6 抗氧化剂  29-30
    1.4.7 降血糖活性物质  30
    1.4.8 抗病毒类活性化合物  30-31
  1.5 植物内生真菌在天然药物研究中存在的问题和发展前景  31-33
    1.5.1 内生菌次生代谢产物多样性是天然药物研究的潜在资源  31-32
    1.5.2 植物内生真菌在天然药物研究中存在的问题和发展前景  32-33
  1.6 立题依据  33
  1.7 拟采用的技术线路  33-35
第2章 植物内生菌活性菌株的筛选  35-52
  2.1 材料  35-36
    2.1.1 菌株  35
    2.1.2 主要培养基  35
    2.1.3 主要实验试剂  35-36
    2.1.4 主要实验仪器与设备  36
  2.2 方法  36-39
    2.2.1 筛选样品的制备  36-37
    2.2.2 活性菌株的筛选  37-39
  2.3 结果  39-50
    2.3.1 筛选样品制备结果  39
    2.3.2 活性菌株筛选结果  39-50
  2.4 小结与讨论  50-52
第3章 植物内生菌的代谢产物研究与菌种鉴定  52-96
  3.1 材料  52-54
    3.1.1 菌种  52
    3.1.2 主要培养基  52-53
    3.1.3 主要实验仪器与设备  53-54
    3.1.4 主要实验试剂  54
  3.2 方法  54-61
    3.2.1 种子、发酵培养  54
    3.2.2 产物的分离纯化  54-55
    3.2.3 化合物的活性测定  55
    3.2.4 菌株鉴定  55-61
  3.3 结果  61-92
    3.3.1 植物内生菌HCCB00167的代谢产物研究  61-71
    3.3.2 植物内生菌HCCB00189的代谢产物研究  71-77
    3.3.3 植物内生菌HCCB01546的代谢产物研究  77-85
    3.3.4 活性菌株的鉴定  85-92
  3.4 小结与讨论  92-96
第4章 化合物HCCB01546-C的抗肿瘤药效学研究  96-104
  4.1 材料  96-97
    4.1.1 瘤源、细胞株及实验动物  96
    4.1.2 受试样品  96
    4.1.3 主要实验试剂  96
    4.1.4 主要实验仪器与设备  96-97
  4.2 方法  97-98
    4.2.1 肿瘤细胞的体外培养  97
    4.2.2 化合物HCCB01546-C对肿瘤细胞的体外抑制实验  97
    4.2.3 化合物HCCB01546-C对小鼠肝癌H22的体内生长抑制的研究  97-98
    4.2.4 化合物HCCB01546-C对小鼠LEWIS肺癌生长抑制作用的研究  98
  4.3 结果  98-102
    4.3.1 化合物HCCB01546-C对多种肿瘤细胞的体外抑制活性  98-99
    4.3.2 化合物HCCB01546-C对A549细胞体外抑制的时效关系  99-100
    4.3.3 化合物HCCB01546-C对小鼠肝癌H22移植瘤体内生长的抑制作用  100-101
    4.3.4 化合物HCCB01546-C对小鼠LEWIS肺癌生长的抑制作用  101-102
  4.4 小结与讨论  102-104
第5章 化合物HCCB01546-C的抗肿瘤作用机制研究  104-114
  5.1 材料  104-105
    5.1.1 细胞株  104
    5.1.2 受试样品  104
    5.1.3 主要实验试剂  104-105
    5.1.4 主要实验仪器与设备  105
  5.2 方法  105-107
    5.2.1 肿瘤细胞的体外培养  105
    5.2.2 HCCB01546-C对肺癌A549体外增殖抑制作用的形态学观察  105
    5.2.3 HCCB01546-C诱导肺癌细胞A549凋亡的能力及周期变化  105-106
    5.2.4 HCCB01546-C对肺癌A549细胞一氧化氮(NO)的影响  106
    5.2.5 HCCB01546-C对人乳腺癌血管内皮生长因子表达的影响  106-107
  5.3 结果  107-111
    5.3.1 化合物HCCB01546-C对肺癌A549细胞形态学上的变化  107
    5.3.2 化合物HCCB01546-C诱导肿瘤细胞凋亡的能力  107-108
    5.3.3 化合物HCCB01546-C对肿瘤细胞A549细胞周期的影响  108-110
    5.3.4 细胞上清液中NO水平的变化  110-111
    5.3.5 化合物HCCB01546-C对人乳腺癌血管内皮生长因子表达的影响  111
  5.4 小结与讨论  111-114
全文总结  114-116
创新点及今后工作设想  116-117
参考文献  117-124
发表文章  124-125
致谢  125-126
附录  126-136

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学
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