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基因工程方法构建含硒抗氧化酶

作　者: 俞慧君
导　师: 沈家骢；刘俊秋
学　校: 吉林大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 抗氧化酶 催化机理 酶模型 工程方法 基因工程 硒蛋白 缺陷型 协同作用 活性部位 催化机制
分类号: O629.8
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)组成了机体清除活性氧的重要酶学防线,能有效保护细胞免遭氧化损伤,也因此具有广阔的药用前景。但天然酶的生物医学应用常被很多因素所限制。如SOD 在一定情况下会产生细胞毒性,只有与其他过氧化物清除酶,如GPX的水平达到一定的平衡时才能真正起到抗氧化作用。而GPX 的催化基团是被称为第21 种氨基酸的硒代半胱氨酸(Sec),很难利用传统的基因工程方法表达。因此,对抗氧化酶的模拟不仅对阐明酶的催化机理以及相互间的协同作用有重要意义,而且还具有重大的药用价值。自然界中多数蛋白质的新功能都是通过对已有的蛋白骨架进行重新设计进化而来。基于这一进化规律,我们从已有的酶模型出发,通过重新设计并采用能有效表达硒蛋白的缺陷型原核表达系统,构建了催化位点结构明确的高效的GPX 酶模型。利用基因融合技术,我们又进一步构筑了兼具GPX 和SOD 活力并可协同作用的双功能抗氧化酶模型。根据我们从亚细胞水平上对模拟酶的生物学效应进行的研究表明它们是强有力的抗氧化剂。1. 硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟GPX 为了获得结构明确,催化位点单一的高效GPX 模拟物,我们利用定点突变和硒蛋白的缺陷型原核表达系统将Lucilia cuprina GST 活性部位的Ser 转变为Sec,得到具有高GPX 活力的含硒酶(seleno-LuGST1-1)。含硒GST 的GPX 活力可与天然酶相媲美。它是第一例用基因工程手段得到的具有高GPX 活力的含硒人工酶。与天然LuGST 相比,含硒GST 对有机氢过氧化物如t-BuOOH 和CuOOH 的催化还原活力大大提高。我们认为高GPX 活力来源于它与GPX 活性部位结构的相似性。实验证明,它的催化机制与天然酶类似,推论这是由于酶活性位点硒原子的氧化还原态相互转化的特殊性质,使seleno-LuGST1-1 催化机制由不依赖硒的顺序机制转换为依赖硒的乒乓机制。成功地转化GST 为GPX 使我们不仅能更好地理解酶的催化机理,而且为GPX 与GST 在进化上具有共同的祖先这一假说提供了证据,同时又一次证明了新酶活力进化的主导因素并不是结合专一性

全文目录


第一章 本论文立论依据  15-22
第二章 硒代谷胱甘肽硫转移酶模拟 GPX  22-62
  第一节 序言  22-24
  第二节 硒代谷胱甘肽硫转移酶表达载体的构建  24-30
    一 实验材料  24-25
      1.1 主要试剂  24-25
      1.2 菌株与质粒  25
      1.3 主要仪器  25
    二 实验方法  25-27
      2.1 目的基因的获得及扩增  25-26
      2.2 目的基因的定点突变S9C 的引入  26
      2.3 突变C86S 的引入  26-27
      2.4 突变C2OOS 的引入  27
      2.5 重组质粒的构建  27
    三 结果与讨论  27-30
      3.1 目的基因的扩增及突变  28-29
      3.2 克隆  29-30
  第三节 硒代谷胱甘肽硫转移酶、野生型谷胱甘肽硫转移酶及其突变体的表达、分离提纯及初步表征  30-38
    一 实验材料  30-31
      1.1 主要试剂  30
      1.2 主要仪器  30-31
      1.3 主要溶液的配制  31
    二 实验方法  31-34
      2.1 野生型 GST 及其突变体的诱导表达  32
      2.2 Seleno-GST 的诱导表达  32-33
      2.3 野生型GST、突变体及Seleno-GST 的分离提纯  33
      2.4 高效液相色谱分离目的蛋白  33
      2.5 质谱鉴定  33-34
      2.6 蛋白质含量的测定  34
      2.7 硒含量的测定  34
    三 结果分析  34-37
      3.1 GST 突变体的表达与分离提纯  34-35
      3.2 Seleno-GST 的诱导表达  35-36
      3.3 Seleno-GST 的分离提纯与初步表征  36-37
    四 讨论  37-38
  第四节 硒代谷胱甘肽硫转移酶的酶学性质分析  38-48
    一 实验材料  38-39
    二 实验方法  39-40
      2.1 活力的测定  39
      2.2 蛋白质含量测定  39
      2.3 最适温度和最适pH 值的测定  39-40
    三 结果分析  40-43
      3.1 Seleno-LuGST1-1 的GPX 与GST 活力  40-42
      3.2 最适温度和最适pH 值  42-43
    四 讨论  43-48
  第五节 硒代谷胱甘肽硫转移酶的动力学分析  48-58
    一 实验材料  48
    二 实验方法  48
      2.1 蛋白质含量测定  48
      2.2 稳态动力学性质研究  48
    三 结果分析  48-54
    四 讨论  54-58
  本章小结  58-59
  参考文献  59-62
第三章 具有 GPX和SOD活力的双功能酶的构建  62-93
  第一节 序言  62-63
  第二节 含硒双功能酶表达载体的构建  63-70
    一 实验材料  63-64
      1.1 主要试剂  63-64
      1.2 菌株与质粒  64
      1.3 主要仪器  64
    二 实验方法  64-66
      2.1 Seleno-LuGST1-1 基因的获得及扩增  64-65
      2.2 SW-SOD 基因的扩增及融合  65
      2.3 重组质粒的构建  65-66
    三 结果与讨论  66-67
      3.1 目的基因的获得及扩增  66
      3.2 克隆  66-67
    四 讨论  67-70
  第三节 含硒双功能酶的表达、提纯及性质研究  70-89
    一 实验材料  70-71
      1.1 主要试剂  70-71
      1.2 主要仪器  71
    二 实验方法  71-75
      2.1 野生型SW-SOD 的诱导表达及分离提纯  72
      2.2 S-GST-SOD 的诱导表达  72-73
      2.3 Seleno-GST-SOD 的诱导表达  73
      2.4 Seleno-GST-SOD 及S-GST-SOD 的分离提纯  73-74
      2.5 蛋白质含量的测定  74
      2.6 Seleno-GST-SOD 及S-GST-SOD 分子量的测定  74
      2.7 活力的测定  74-75
      2.8 Seleno-GST-SOD 和SOD 抗H_2O_2 氧化的能力的测定  75
      2.9 Seleno-GST-SOD 的GPX 活力的动力学性质的测定  75
    三 结果分析  75-82
      3.1 野生型SW-SOD 的表达及提纯  75-76
      3.2 Seleno-GST-SOD 与S-GST-SOD 的表达与提纯  76-78
      3.3 Seleno-GST-SOD 及S-GST-SOD 分子量的测定  78-79
      3.4 Seleno-GST-SOD 及S-GST-SOD 的GPX 和SOD 活力  79-80
      3.5 Seleno-GST-SOD 的GPX 活力的动力学性质  80-81
      3.6 Seleno-GST-SOD 的GPX 与SOD 活力的协同作用  81-82
    四 讨论  82-89
  本章小结  89-90
  参考文献  90-93
第四章 抗氧化酶模拟物生物学效应的研究  93-120
  第一节 序言  93-95
  第二节 硒代谷胱甘肽硫转移酶的生物学效应  95-99
    一 实验材料与仪器  95
      1.1 实验材料  95
      1.2 主要仪器  95
    二 实验方法  95-96
      2.1 牛心线粒体的制备  95
      2.2 Fe~(2+)/Vc 诱导线粒体损伤  95-96
      2.3 线粒体膨胀度的测定  96
      2.4 脂质过氧化水平的测定  96
    三 结果分析  96-98
      3.1 seleno-LuGST1-1 对损伤线粒体膨胀度的影响  96-97
      3.2 seleno-LuGST1-1 对线粒体脂质过氧化的抑制  97-98
    四 讨论  98-99
  第三节含硒双功能酶的生物学效应  99-104
    一 实验材料与仪器  99-100
      1.1 实验材料  99-100
      1.2 主要仪器  100
    二 实验方法  100
      2.1 牛心线粒体的制备  100
      2.2 Xanthine / XOD / Fe~(2+)诱导线粒体损伤  100
    三 结果分析  100-102
      3.1 Seleno-GST-SOD 对损伤线粒体膨胀度的影响  100-101
      3.2 Seleno-GST-SOD 对线粒体脂质过氧化的抑制  101-102
    四 讨论  102-104
  第四节 GPX 模拟物对DNA 氧化损伤的保护作用  104-116
    一 实验材料  104
      1.1 主要试剂  104
      1.2 主要仪器  104
    二 实验方法  104-105
      2.1 GSH/Fe~(3+)/O_2 损伤体系  104
      2.2 DTT/Fe~(3+)/O_2 损伤体系  104-105
      2.3 t-BuOOH 损伤体系  105
    三 结果分析  105-113
      3.1 GSH/Fe~(3+)/O_2 体系对质粒DNA 的损伤及GPX 模拟物的保护作用  105-107
      3.2 DTT/Fe~(3+)/O_2 体系对质粒DNA 的损伤及GPX 模拟物的保护作用  107-110
      3.3 t-BuOOH 对质粒DNA 的损伤及GPX 模拟物的保护作用  110-113
    四 讨论  113-116
  本章小结  116-117
  参考文献  117-120
第五章 文献综述  120-166
  第一节 硒代半胱氨酸的生物合成  120-127
    一 硒蛋白的生物合成  120-122
    二 原核生物的硒代半胱氨酸插入元件  122-123
    三 真核生物的 SECIS  123-125
    四 硒蛋白的原核表达  125-126
    五 利用半胱氨酸缺陷型大肠杆菌原核表达硒蛋白  126-127
  第二节 谷胱甘肽过氧化物酶  127-138
    一 谷胱甘肽过氧化物酶的结构  127-129
      1.1 牛 CGPX 的二级结构  127-128
      1.2 牛cGPX 活性中心的结构  128-129
      1.3 人 PGPX 的活性中心结构  129
    二 谷胱甘肽过氧化物酶的生物学作用  129-131
    三 谷胱甘肽过氧化物酶的催化机制  131-134
      3.1 乒乓机制  131-132
      3.2 顺序机制  132-134
    四 谷胱甘肽过氧化物酶的人工模拟  134-138
      4.1 小分子化学酶模型  134-136
      4.2 含硒抗体酶  136-137
      4.3 生物印迹酶  137-138
      4.4 半合成含硒酶  138
  第三节 超氧化物歧化酶  138-147
    一 SOD 的来源、种类和分布  139-141
    二 SOD 的结构  141-145
      2.1 一级结构与序列同一性  141-142
      2.2 三维结构  142-143
      2.3 活性中心  143-144
      2.4 SOD 的结构稳定性  144-145
    三 SOD 的活力测定  145-146
    四 SOD 的生物学作用  146-147
  第四节 谷胱甘肽转硫酶  147-156
    一 GST 的解毒作用  148-150
    二 GST 的晶体结构  150-154
    三 哺乳动物的GST 的分类标准  154-155
    四 GST 分类的进化意义  155-156
  参考文献  156-166
结论  166-168
作者简历  168-170
致谢  170-171
中文摘要  171-175
ABSTRACT  175-179

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 有机化学 > 天然化合物 > 酶、激素
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