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表达γ-亚麻酸的无标记转基因大豆的培育

作　者: 张秀春
导　师: 林俊芳；彭明
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: △~6-脂肪酸脱氢酶基因 γ-亚麻酸 大豆 无标记基因 转化
分类号: S565.1
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


γ-亚麻酸（GLA）是多不饱和脂肪酸,分子式C18H30O2,化学名称6,9,12-十八碳三烯酸。研究发现GLA具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗粥样硬化等作用。此外,GLA还可以用于糖尿病的辅助治疗、锌缺乏症的改善,对更年期综合症、帕金氏症等多种病症也具有不同的治疗效果。Δ6—脂肪酸脱氢酶基因（delta 6 fatty acid desaturase,D6D）是亚油酸转化为γ-亚麻酸的限速酶。大豆是重要的油料作物之一,富含亚油酸,亚油酸含量占脂肪酸总量的40%-60%,而不含γ-亚麻酸或含量极低。当前应用的转化体系都需要抗生素或除草剂抗性基因作为标记基因,以便能够在大量的非转化细胞中筛选转化细胞。现在人们已经对标记基因,尤其是粮食和油料作物遗传转化中运用的标记基因表示了极大的关注。 本研究采用RT—PCR的方法从玻璃苣中克隆了Δ6—脂肪酸脱氢酶基因（D6D）,并进行cDNA序列测定。结果表明:D6D全长1344bp,编码448个氨基酸。D6D序列在genbank中采用BLAST程序进行同源序列分析,D6D核苷酸序列与克隆自美国德克萨斯州的玻璃苣Δ6—脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列完全相同。D6D克隆进pGEMRT-easy Vector后形成质粒pGΔ6—DSA。把质粒pGΔ6—DSA上的D6D片段克隆进含有T—DNA和35S启动子的质粒pGIN22中,形成含有目的基因的表达载体pGIN23。把表达载体pGIN23与另一个含有T—DNA、启动子、筛选标记基因的表达载体pLPN28进行亚克隆,使得筛选标记基因和D6D分别插入到同一质粒的两个相互独立的T—DNA内,构建成共转化表达载体pLIN61。在转化过程中,形成两种类型的T-DNA:一种T-DNA含有bar基因,一种T-DNA含有D6D基因,这两种T-DNA能整合到不同的染色体位置,通过转基因植株后代分离就可以得到无标记基因只含D6D基因的转基因植株。将共转化表达载体pLIN61转入根癌农杆菌EHA101中,以该工程菌对大豆进行转化试验。 从5个南方栽培品种中,选取莆豆8008作为实验材料,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统将来源于玻璃苣的Δ6—脂肪酸脱氢酶基因成功的导入大豆。从发芽5-7天的大豆无菌苗切取子叶节为外植体,农杆菌侵染30min后,在大豆共培养基上,于25℃黑暗条件下共培养3天。三天后取出外植体,用大豆漂洗培养基漂洗两次并浸泡20min,滤纸吸干后使胚轴朝下植入大豆丛生芽诱导培养基中,于28℃光照条件下培养四周,每两周转接一次。一般经4周培养出现抗性不定芽。不定芽长出后切除子叶部分,转接至抗性仲长培养基上筛选培养,每两周继代一次,直到抗性再生苗长至2cm-3cm高度。存活的抗性再生苗转到不含Qlufosinate

全文目录


1 前言  9-35
  1.1 γ-亚麻酸的研究进展  9-14
    1.1.1 多不饱和脂肪酸的生物合成途径  9-10
    1.1.2 γ-亚麻酸的发现历史  10-11
    1.1.3 γ-亚麻酸及其代谢产物的生理功能  11-12
    1.1.4 γ-亚麻酸的生物资源  12-14
  1.2 Δ~6-脂肪酸脱氢酶的研究进展  14-18
    1.2.1 脂肪酸脱氢酶  14-15
    1.2.2 Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因(Δ~6-fatty acid desaturase，D6D)的研究  15-17
    1.2.3 基因工程研究  17-18
  1.3 大豆研究进展  18-26
    1.3.1 大豆转基因的受体系统  18-20
    1.3.2 大豆遗传转化方法  20-24
    1.3.3 转基因大豆生产及其生物安全性评价  24-26
  1.4 标记基因的安全性问题  26-32
    1.4.1 选用安全的标记基因  27-28
    1.4.2 无选择标记的转基因技术  28-32
  1.5 本研究的目的和意义  32-34
  1.6 表达γ-亚麻酸的无标记基因转基因大豆的培育  34-35
2 材料与方法  35-52
  2.1 材料  35
    2.1.1 植物材料  35
    2.1.2 菌种及质粒  35
    2.1.3 主要化学试剂  35
  2.2 方法  35-52
    2.2.1 Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆与测序  35-41
    2.2.2 植物表达载体的构建  41-42
    2.2.3 大豆的遗传转化及转基因植株的分析  42-52
3 结果与分析  52-81
  3.1 Δ~6—脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建  52-56
    3.1.1 RT—PCR扩增  52
    3.1.2 目的片段的克隆  52-53
    3.1.3 目的片段的序列测定与分析  53
    3.1.4 表达载体pLIN61构建  53-55
    3.1.5 表达载体pLIN61的PCR鉴定和酶切鉴定  55-56
  3.2 大豆的遗传转化和转基因植株的分析  56-81
    3.2.1 三亲交配PCR检测与酶切鉴定  56-57
    3.2.2 不同大豆品种子叶节丛生芽诱导率的比较  57-58
    3.2.3 大豆子叶节不定芽分化和伸长的除草剂Glufosinate梯度实验  58-60
    3.2.4 大豆转化抗性再生植株的获得及转化频率  60-61
    3.2.5 大豆转化抗性再生植株除草剂Glufosinate抗性检测  61
    3.2.6 大豆转化抗性再生植株的PCR检测  61-63
    3.2.7 大豆转化抗性再生植株的Southern杂交证实  63-65
    3.2.8 转基因大豆目的基因D6D的表达  65
    3.2.9 T_1代转基因植株的PCR扩增  65-68
    3.2.10 T_1代转基因植株的Southern杂交检测  68-71
    3.2.11 T_1转基因植株除草剂抗性鉴定  71-73
    3.7.12 T_2代转基因植株的除草剂抗性鉴定和PCR扩增  73-75
    3.2.13 T_2代转基因植株的Southern blot检测  75-77
    3.2.14 无标记基因T_2代种子的Northern杂交检测  77-78
    3.2.15 转基因大豆脂肪酸的气相色谱(GC)分析  78-81
4 讨论  81-85
  4.1 无标记转基因植株的获得  81-82
  4.2 Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的表达  82-83
  4.3 转基因植株后代的分离  83
  4.4 转基因植物中的基因沉默现象  83-85
5 结论  85-86
参考文献  86-93
缩写词及其英汉对照  93-94
附录  94-100
  Ⅰ 大豆组织培养培养基配方：  94-98
  Ⅱ 彩版  98-99
  Ⅲ 作者简历  99-100
致谢  100

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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