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耐辐射奇球菌抗辐射相关ncRNA的筛选验证和功能研究

作　者: 李顺杰
导　师: 郭江峰
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 耐辐射奇球菌辐射抗性 ncRNA Riboswtich DicF
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,D. radiodurans)是迄今为止发现的辐射抗性最强的生物,最初认为耐辐射奇球菌具有针对电离辐射和紫外辐射的特殊保护机制,后来发现耐辐射奇球菌经大剂量γ射线照射后也会产生严重的DNA损伤,整个基因组产生约150-200个DNA双链碎片,约3000个单链片段和至少1000个损伤位点。由此推测耐辐射奇球菌并不具有特别的保护DNA不受辐射损伤的机制,其超强的辐射抗性得益于高效准确的DNA修复能力。因此,国内外对耐辐射奇球菌辐射抗性的研究主要集中在其DNA修复机制上。近年来,在原核生物中发现了越来越多的非编码RNA(Noncoding RNA,ncRNA)。无论是在真核还是原核生物中ncRNA都发挥着重要的调控作用,到目前为止却尚未发现对ncRNA与耐辐射奇球菌的辐射抗性之间的关系进行研究的报道。本文利用生物信息学手段,结合前人的研究成果,从耐辐射奇球菌中筛选了7条预测所得的候选ncRNA进行实验,对这7条ncRNA及内参16s设计特异性引物,进行RT-PCR检测,结果有4条得到较好的结果。对这4条ncRNA的RT-PCR产物进行测序验证,结果表明序列与预期的完全相符。这4条ncRNA包括3条riboswitch(TPP riboswtich、SAM riboswitch、FMN riboswitch)和DicF,其中3条ribosiwitch能够在Rfam数据库中查询到,已有人对其进行过报道或预测;而DicF是从大肠杆菌中被发现的,从未有报道指出在耐辐射奇球菌中存在。为了进一步确认,采用Northern blot对其进行了验证,结果在与阳性对照相近的位置得到了杂交信号,说明DicF很可能在耐辐射奇球菌中被表达。为进一步研究这些ncRNA的功能,采用γ射线对耐辐射奇球菌进行辐照处理,然后继续在正常条件下培养,在其DNA修复的过程中每个半小时取样,抽提总RNA;利用荧光定量PCR技术检测这些ncRNA的表达差异。结果发现:FMN riboswitch与SAM riboswitch在菌体受到6 kGy剂量的辐照后3 h内整体上都表现为先上调后下调的趋势,但具体的变化情况有所不同;TPP riboswitch则一直表现为下调,在前1.5 h中逐步增加,其后表达量有所上升,但变化不大;对DicF的检测由于受到样品量的限制,只取了0 h、1 h、2 h、3 h四个点,而不像其他ncRNA那样检测七个点,结果表明DicF的表达在前两个小时都要高于对照组,而在3 h时表达要低于对照组,推测DicF在耐辐射全球菌中与在大肠杆菌一样具有抑制细胞分裂的作用。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-10
目录  10-13
略语表  13-14
第一章文献综述  14-26
  1 耐辐射奇球菌概述  14-20
    1.1 耐辐射奇球菌的基本特征  14
    1.2 耐辐射奇球菌的全基因组序列  14-15
    1.3 耐辐射奇球菌的抗辐射机制研究进展  15-20
      1.3.1 菌体结构对辐射抗性的作用  15-16
      1.3.2 修复蛋白的保护机制  16
      1.3.3 DNA 损伤修复机制是辐射抗性的关键  16-19
        1.3.3.1 同源重组  17
        1.3.3.2 特殊的与DNA 修复相关的蛋白  17-18
        1.3.3.3 ESDSA 途径  18-19
      1.3.4 其他相关因素  19-20
    1.4 耐辐射奇球菌研究的应用前景  20
  2 原核生物非编码RNA(sRNA)研究进展  20-24
    2.1 原核生物ncRNA 种类  20-23
      2.1.1 持家sRNA  20-21
      2.1.2 调控性sRNA  21-23
        2.1.2.1 MicF RNA  21-22
        2.1.2.2 RNAⅢ  22
        2.1.2.3 OxyS RNA  22-23
        2.1.2.4 DicF RNA  23
      2.1.3 核糖核开关(Riboswitch)  23
    2.2 原核生物ncRNA 的调控机制  23
    2.3 原核生物ncRNA 研究方法  23-24
    2.4 原核生物ncRNA 的研究方向  24
  3 小结  24-26
第二章实验方案设计  26-28
  1 研究目的和意义  26
  2 研究的主要内容  26-27
  3 实验流程图  27-28
第三章材料与方法  28-37
  1 材料  28-30
    1.1 数据来源  28
    1.2 菌种  28
    1.3 引物  28-29
    1.4 其他材料  29
    1.5 主要试剂  29-30
  2 方法  30-37
    2.1 ncRNA 筛选  30
    2.2 耐辐射奇球菌培养  30
    2.3 总RNA 提取方法优化  30-31
    2.4 DNase I 处理总RNA  31
    2.5 逆转录反应  31-32
    2.6 PCR 反应  32-33
    2.7 TA 克隆  33-34
    2.8 菌液样本辐照处理  34
    2.9 辐照菌液总RNA 样品抽提  34
    2.10 Northern blot 检测DicF  34-36
      2.10.1 RNA 电泳及转膜  34-35
      2.10.2 生物素标记探针制备  35
      2.10.3 杂交  35-36
    2.11 荧光定量PCR 检测ncRNA 表达差异  36-37
第四章结果与分析  37-48
  1 ncRNA 筛选结果  37
  2 总提取方法的优化  37-39
  3 各ncRNA RT-PCR 检测结果  39-41
  4 四条ncRNA 的TA 克隆测序  41
  5 DicF Northern blot 结果分析  41
  6 辐照处理菌液总RNA 样品抽提  41-43
  7 荧光定量PCR 检测ncRNA 表达差异分析  43-48
    7.1 扩增产物特异性分析  43-44
    7.2 内参标准曲线制作  44
    7.3 三条riboswitch 在不同处理样品之间的表达差异分析  44-46
    7.4 DicF 在不同处理样品之间的表达差异分析  46-48
第五章讨论  48-52
  1 总RNA 样品抽提方法选择的考虑因素  48-49
  2 ncRNA 表达量与耐辐射奇球菌DNA 修复的关系  49
  3 ncRNA 的功能分析  49-52
    3.1 Riboswitch 功能分析  49-51
    3.2 DicF RNA 功能分析  51-52
第六章总结与展望  52-53
参考文献  53-60
附录一重要试剂的配制  60-63
致谢  63

耐辐射奇球菌抗辐射相关ncRNA的筛选验证和功能研究

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