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含phoN重组菌D.radiodurans的构建及其富集U（Ⅵ）性能的试验研究

作　者: 梁颂军
导　师: 谢水波
学　校: 南华大学
专　业: 市政工程
关键词: 重组菌非特异性酸性磷酸酶基因耐辐射奇球菌铀生物富集
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

含编码非特异性酸性磷酸酶基因(phoN)的细菌如柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)等能有效地吸附去除废水中的重金属,但这类微生物对辐射敏感。耐辐射奇球菌(Deinoeoeeus radiodurans)是最抗辐射的生物之一,存活的辐射剂量高达15kGy。利用基因工程技术将phoN克隆到D. radiodurans中,使之能在辐射环境下更大容量富集水中的U(Ⅵ),实现铀等放射性重金属污染的有效生物修复及再资源化,具有重要的科学意义。本研究内容包括目的基因的扩增,重组穿梭表达载体的构建、重组菌的筛选、PhoN蛋白的表达及重组菌D. radiodurans富集U(Ⅵ)性能的研究等。以Salmonella enterica serovar Typhimurium基因组DNA为模板,PCR扩增得到phoN,将其克隆到pMD18T-Vector中。用SpeⅠ、NdeⅠ限制性内切酶对重组转移载体T-VectorphoN与穿梭载体pRADZ3分别进行双酶切,再将phoN片段和穿梭载体pRADZ3中的大片段通过T4DNA连接酶连接。经PCR与双酶切双重鉴定,证实重组穿梭载体pRADZ3phoN构建成功。转化E. coli DH5α与D.radiodurans感受态细胞,使其在正常情况下(不需诱导剂)表达PhoN蛋白,经Western blot证实phoN基因在E.coli DH5α与D. radiodurans中成功表达。重组菌E. coli与重组菌D. radiodurans富集U(Ⅵ)的实验表明,重组菌对U(Ⅵ)的去除率较相应的宿主菌均有较大的提高,其中重组菌D. radiodurans对U(Ⅵ)的富集量较宿主菌D. radiodurans的增加约2倍,去除率达85.64%。比较重组菌D. radiodurans与宿主菌D. radiodurans的生长曲线,表明重组穿梭质粒的导入使得重组菌的生长受到抑制。pH对重组菌D. radiodurans富集U(Ⅵ)的过程有显著影响。当pH为6时去除率达到最大值88.32%,在低pH下,去除率极低。在60min时基本达到了吸附平衡。其富集量与菌体浓度负相关,与铀起始浓度正相关。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-24
  1.1 生物吸附法处理含铀废水  8-12
  1.2 基因工程技术的原理及步骤  12-14
  1.3 含重金属抗性基因工程菌的构建与应用  14-19
  1.4 耐辐射奇球菌及其生物修复放射性污染  19-22
  1.5 研究意义、内容与技术路线  22-24
第二章试验材料与方法  24-37
  2.1 试验仪器  24-25
  2.2 材料与试剂  25-28
  2.3 试验方法  28-36
  2.4 本章小结  36-37
第三章含phoN重组菌D.radiodurans的构建  37-55
  3.1 引物的设计  37-39
  3.2 PCR体外扩增phoN基因  39-40
  3.4 重组转移载体T-VectorphoN的构建  40-47
  3.5 重组穿梭载体pRADZ3phoN的构建  47-50
  3.6 phoN基因在E coli DH5α中的表达  50-51
  3.7 重组菌E.coli对U(Ⅵ)的富集  51
  3.8 D.radiodurans转化菌株菌液PCR鉴定结果  51-52
  3.9 phoN基因在D.radiodurans中的表达  52-53
  3.10 重组菌D.radiodurans对U(Ⅵ)的富集  53-54
  3.11 本章小结  54-55
第四章含phoN重组菌D.radiodurans富集U(Ⅵ)的结果与分析  55-61
  4.1 重组菌D.radiodurans的生长曲线  55-56
  4.2 影响重组菌D.radiodurans富集U(Ⅵ)的因素  56-60
  4.3 本章小结  60-61
第五章结论与建议  61-63
  5.1 结论  61-62
  5.2 创新点  62
  5.3 建议  62-63
参考文献  63-69
附录A  69-71
论文发表情况  71
参与项目  71-72
致谢  72

含phoN重组菌D.radiodurans的构建及其富集U（Ⅵ）性能的试验研究

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