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随着对肿瘤放射敏感性的研究和认识不断深入,从最初的组织水平和细胞水平到目前的分子生物学水平和基因水平,人们认识到肿瘤甚至部分良性疾病的辐射抗性除了与DNA损伤修复方面的机制密切相关外,与多种信号转导通路,与凋亡,与基因都有着千丝万缕的联系,并试图从不同水平改变和调节肿瘤细胞和正常细胞的放射敏感性。近年来,利用现代分子生物学技术阻断肿瘤细胞关键的信号通路,促进肿瘤细胞死亡和凋亡,进而提高放化疗效果,引起国内外学者的重视,成为肿瘤治疗研究的热点之一。肿瘤的发生、发展与生长分化相关的信号传导通路的异常激活密切相关。生长因子和细胞因子作为细胞增殖的重要胞外刺激因子,与相应受体结合后,通过许多条信号通路的信号转导作用将细胞外信号传递到细胞内引起细胞的增殖和分化。JAKs/STATs是相对比较重要的信号转导途径之一,而STAT3则是STATs家族的令人瞩目的重要成员,在肿瘤的形成和发展过程中起着重要的作用。STAT3是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道相耦联的具有关键作用的双功能蛋白。激活后形成二聚体转入细胞核内,识别并结合到靶基因DNA特异的反应元件,诱导细胞生长、分化、凋亡相关基因(Bcl-xL、Mcl-l、c-Myc、Cyclin D1、VEGF、p53)等基因表达。具有内在酪氨酸激酶活性的生长因子受体,如表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)等可直接磷酸化STAT3蛋白。Src激酶和Ab1及其它如v-ras、Lck等癌蛋白酪氨酸激酶也能直接磷酸化STAT3蛋白。STAT3二聚体完成特定的信号传递后,被一种未知的酪氨酸磷酸酶去磷酸化,并重新回到细胞质中。但是最近也有研究表明STAT3蛋白可以在胞浆与胞核间不停穿梭,且不依赖于STAT3的磷酸化,类似的现象在STAT1和STAT5中也可以见到,有待于进一步的研究证实。反义技术应用于新型抗肿瘤药物研究和开发为我国在肿瘤药物研究领域占有一席之地提供了良好的机遇。目前国际上抗肿瘤反义核酸药物研究已经取得了很大进展,已有一种反义药物应用于临床,多种反义药物正进行二期三期临床实验反义药物正显示着良好的应用前景。但是国际上的反义核酸药物均申请了发明专利,具有绝对的技术和应用上的专有性和垄断权,一旦开发成功,我国只能高价引进。使我们处于极其不利和被动地位。因此开展具有自主知识产权的抗肿瘤药物相关研究具有战略意义。目前已有结合放射和反义核酸的研究,如:反义Ku70(DNA损伤修复相关基因)、RAF、peroxiredoxin II(过氧化物还原酶)、PKA1(蛋白激酶A1)、P21 WAF\CIP1、Bcl-xL研究,其报道的结果无一例外地增强了相应细胞的放射敏感性。但是上述研究由于选择的靶位不同,其抗肿瘤的效果还不理想,离实际应用还有较大距离。因此,寻找更好的关键基因靶位,设计、筛选出更高效的反义核酸序列,是国际上抗肿瘤反义核酸技术研究的重点。本课题选择近年来国际上高度关注、极有可能成为反义核酸抗肿瘤关键作用的STAT3作为基因靶位,利用RNAstructure 4.2软件和网络资源,模拟STAT3 mRNA二级结构,进一步利用软件的步移法(oligowalk)模块设计出一系列反义序列,联合辐射因素,观察其对肿瘤辐射敏感性的影响,并以文献报道的已知序列作为阳性对照,筛选出高效的反义STAT3序列。在此基础上,探讨反义STAT3削弱肿瘤细胞辐射敏感性的相关机制,研究将分子生物学手段与传统放射治疗手段联合应用治疗辐射抗性肿瘤的可行性。研究内容第一,STAT3反义序列的设计:利用RNAstructure 4.2软件和网络资源,模拟STAT3 mRNA二级结构,进一步利用软件的步移法(oligowalk)模块,针对低自由能靶点,设计出一系列反义序列,并合成、修饰增强其稳定性。第二,高效STAT3反义序列的筛选:以文献报道的已知反义STAT3序列作为阳性对照,对上述反义序列进行筛选,筛选出更高生物学活性的STAT3反义序列。第三,探讨高效反义STAT3转染后细胞辐射抗性的变化及其作用规律:将筛选出的高效STAT3反义序列转染肿瘤细胞后,体外观察细胞辐射敏感性的变化,寻求其作用规律。第四,研究反义STAT3削弱肿瘤细胞辐射敏感性的相关机制:通过观察细胞的增殖状态、凋亡状况、细胞周期的变化、STAT3表达和活力变化、下游相关基因的表达变化,初步阐明反义STAT3对细胞辐射敏感性的影响的相关机理。实验方法用RNAstructure 4.2软件和网络资源,模拟STAT3 mRNA二级结构,进一步利用软件的步移法(oligowalk)模块,针对低自由能靶点,设计出一系列反义序列,并合成、修饰增强其稳定性,以文献报道的已知反义STAT3序列作为阳性对照,脂质体包裹各反义序列,在96孔板以200nmol/L浓度为转染浓度,转染细胞48h后,用CCK-8实验方法观察各序列对肿瘤细胞的增殖抑制效果,筛选出更加高效的反义序列。进一步利用CASY细胞计数分析仪研究高效反义序列对肿瘤细胞的增殖抑制效果,利用Hoechst33258染色对各种因素作用后的细胞作形态学上的初步观察,判别凋亡细胞数量变化的趋势;用AnnexinⅤ/PI复染,流式细胞仪检测不同因素处理后细胞凋亡百分率的变化,用PI单染分析反义转染后细胞周期的变化,研究反义STAT3对恶性肿瘤辐射敏感性的改变情况,观察两者的协同效应。通过蛋白杂交研究转染STAT3蛋白表达与活化水平以及相关下游基因的变化,观察反义序列对蛋白表达和活化的阻断作用,对反义序列改变肿瘤细胞辐射敏感性的机制作初步的探讨。实验结果1、反义STAT3序列的设计与合成利用先进的反义序列设计软件,设计得到10条新的反义STAT3序列,分别命名为AS1~AS10,他们的总自由能介于-9.6~-25.8之间,皆明显低于文献报道的已知序列ASC。2、新反义STAT3序列对A549细胞的作用2.1对肿瘤细胞增殖抑制效果:以文献报道的已知序列ASC作为阳性对照,CCK-8检测AS1~AS10各序列对A549细胞的增殖抑制效果。发现AS5~AS7三个组对A549细胞的增殖抑制效果与ASC组的作用相当,无显著差异(P>0.05),其余7组对A549细胞的增殖抑制效果明显优于ASC组(P<0.01),其中AS10组效果最好,增殖抑制率达75.64%,比ASC组的增殖抑制率提高了近4倍。而AS4与AS8的增殖抑制率也分别达到65.88%、65.97%。2.2对肿瘤细胞凋亡促进作用:DNA染色剂Hoechst33258染色结果表明反义STAT3转染后48小时,部分细胞开始出现较明显的细胞凋亡的形态学表现。可见光下凋亡细胞表现为胞膜皱缩,体积变小,部分从其附着处脱落下来或与周围细胞分离。荧光显微镜下正常细胞核较大,染色质分布均匀;凋亡细胞核固缩变小,细胞核呈致密浓染,部分染色质边缘化,或呈碎块状致密染色;而无义对照组与无干涉对照组相比差别并不明显,并且未见典型的凋亡形态的细胞出现。Annexin V/PI双染结果显示反义核酸与A549细胞作用48h后早期凋亡细胞增多。正常对照组的早期细胞凋亡率为5.18%,NS组的早期细胞凋亡率接近正常对照组,为4.35%,两者相比差异无统计学意义(P>0.05);而AS10组的A549细胞作用48h后早期凋亡细胞增多,为11.51%,与对照组、NS组相比均有十分显著的统计学差异(P<0.01),表明AS10反义核酸能够促进A549细胞的早期凋亡。3、不同浓度AS10对A549细胞的增殖抑制效果选择不同浓度最优序列AS10,与已知序列ASC和无义序列NS作A549细胞的增殖抑制效果比较,通过CCK-8检测计算各组的存活分数,统计结果分析表明:(1)AS10对A549细胞的增殖抑制效果显著由于AS10。在50~300nmol/L范围内,相同浓度的AS10序列的抑制率非常显著高于相同浓度的ASC序列(P<0.01)。(2)AS10对A549细胞的增殖抑制效果随浓度增高而增强。在0到150nmol/L范围内,反义核酸浓度越高,其增殖抑制效应越强(P<0.01)。4、反义STAT3转染联合辐射作用对A549细胞辐射敏感性的影响4.1对肿瘤细胞增殖抑制效果:在较低剂量区(0~8Gy)与不转染或无义转染对照相比,反义STAT3增殖抑制作用明显增强(P<0.01),较高剂量区( >8Gy)两者差别减小。按公式:细胞活力(%)=(药物组OD值-本底/对照组OD值-本底)×100%,对数据进行转换,计算细胞活力,表明除了简单的叠加作用因素外,反义转染对肿瘤细胞的有比较明显的增敏作用,低剂量区增敏作用比较明显,高剂量区不明显。4.2对肿瘤细胞凋亡促进作用:反义STAT3联合辐射作用后,在正常无处理组和NS组,可见大小均匀、分布较密的正常细胞核形态,两组之间未见明显差异;在AS10组可见细胞核分布较稀,都部分典型的凋亡小体;在单纯16Gy照射组和NS+16Gy照射组,未见典型的凋亡细胞,但细胞核分布较未照射组稀,两组之间未见明显差异,可见A549细胞为辐射抗性细胞,单纯16Gy照射不能诱导细胞的凋亡;在AS10+16Gy照射组,可见细胞核分布稀疏,有较多的典型凋亡细胞出现,可见反义核酸能够增强A549细胞的辐射敏感性。细胞转染24 h后加以不同剂量γ线照射,照后48h内Annexin V/PI染色,上流式检测,统计处理各组细胞的早期凋亡率,在相同照射剂量条件下,AS10转染+照射组细胞早期凋亡率较单纯照射组和NS转染+照射组均有不同程度的增加,有明显的统计学差别(P<0.01),并且随着照射剂量的增加,早期凋亡率也有显著上升(P<0.01)。而NS转染+照射组与单纯照射组各相应剂量点处相比未见明显差异(P>0.05)。5、反义STAT3对A549细胞抑制作用的机理探讨5.1反义STAT3转染后STAT3总蛋白表达及其磷酸化水平的变化:反义STAT3转染后48h,抽提细胞总蛋白,进行Western blot杂交检测各处理组STAT3总蛋白表达及其磷酸化水平的变化。结果表明,反义组STAT3蛋白表达水平及磷酸化水平均明显低于无义组和正常对照组。5.2反义STAT3对A549细胞下游基因蛋白表达的变化:结果表明,反义STAT3转染后,A549细胞内STAT3下游基因CyclinD1、Bcl-xL蛋白表达水平均明显低于无义组和正常对照组。5.3反义STAT3对A549细胞周期的影响:通过PI染色、流式细胞仪分析细胞周期各时相的百分比,我们发现,AS10转染后S期的细胞为23.70%,而正常对照组S期的细胞为44.47%,NS组S期的细胞为39.08%;并且发现AS10转染后G1期的细胞明显增多,为63.96%,而正常对照组和NS组G1期的细胞则分别为48.49%、47.37%。表明反义核酸能够减少S期的A549细胞,使A549细胞发生G1期阻滞。讨论STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道的汇聚的焦点,调节下游多个靶基因如Bcl-xL、Bcl-2、Mcl-1、c-Myc、VEGF、P21WAF\CIP1、CyclinD1等的表达,在多种肿瘤细胞和组织中都有激活,是近年来备受国内外备受关注的一个重要基因靶点。反义技术研究最重要的是要找准关键基因靶点和获得高效反义寡核苷酸序列。目前认为,反义寡核苷酸的活性主要取决于选择靶基因上理想的可接近位点,因此对RNA二级结构的认识程度是反义药物设计的关键。随着计算机技术的飞速进步,热力学和比较序列分析研究所取得的进展,用计算机软件预测RNA二级结构的准确性已大大提高,这为选择理想反义靶点提供有力的支持,RNAstructure4.2是Mathews DH教授等2004年最新推出的版本,它对RNA二级结构预测的准确率较老版本有了进一步的提高,其中步移法(oligowalk)模块是专为反义药物设计所用的子目录。本研究就是利用该软件设计出10条总自由能(Overall△G37)相对较低的序列,用CCK-8实验方法检测其对A549细胞的增殖抑制效果,与文献报道的已知序列进行对比。我们的实验结果表明其中7条序列明显优于已知阳性对照(P<0.01),获得了具有自主知识产权的高效反义STAT3序列。说明利用RNAstructure4.2软件模拟mRNA的二级结构,以及利用步移法(oligowalk)模块设计出总自由能较低的序列,有助于获得更有效的反义药物。在实验中我们发现,用新设计和筛选出的AS10序列转染后,对A549细胞产生了强烈的增殖抑制效应,在一定浓度范围内,其效应呈浓度依赖性,并且能有效的诱导A549细胞的凋亡。AS10对肿瘤细胞的增殖抑制效应,很可能与其抑制STAT3蛋白的表达和活化,阻断STAT3信号通路后下游CyclinD1等表达降低有关,CyclinD1是细胞周期G1/S期检查点最重要的正向调控因子,CyclinD1蛋白的作用是使Rb蛋白磷酸化而导致它与转录因子E2F的解离,而发挥E2F转录因子的作用,使细胞进入S期,决定着细胞是否能进入分裂周期。分析显示,AS10转染后,A549细胞S期的比例明显减少,使A549细胞发生了G1期阻滞。可能是反义STAT3下调了细胞周期、细胞增殖相关的基因如Cyclin D1、c-Myc、等的表达,使细胞不能通过G1期的检查点,发生周期阻滞,进而对细胞产生了增殖抑制效应。AS10诱导A549细胞产生凋亡的机理,与AS10序列转染后A549细胞STAT3蛋白的表达量下降,磷酸化水平降低,其下游蛋白Bcl- xL等表达降低有关。Bcl- xL蛋白是一种抗凋亡基因,属于Bcl-2家族中的一员,它可以和自身及家族的其他成员形成同二聚体或异二聚体,阻止细胞色素c从线粒体中的释放,从而抑制凋亡级联反应的激活,参与抑制细胞的程序性死亡。文献报道它在多种肿瘤细胞内高表达,能阻止化疗和放疗诱导的凋亡,使肿瘤细胞具有化疗和放疗的抗性。本实验中AS10序列能够有效的抑制A549细胞中STAT3蛋白的表达和活化,阻断STAT3信号通路,下调Bcl- xL的表达,也可能对其他下游抗凋亡基因如Bcl-2、Mcl-l等的表达也有一种作用,进而诱导了细胞的凋亡。但是我们发现仅仅依靠反义STAT3本身不能彻底杀伤肿瘤细胞,而且浓度过大也会对细胞产生非特异性的毒性效应,表明反义STAT3本身对肿瘤细胞的杀伤作用有一定局限性,不能通过无限制的提高反义核酸的浓度来提高其杀伤肿瘤的作用,需要进行反义技术与其他放化疗相结合的探索性研究。本研究中我们探讨高效反义STAT3与60Coγ射线照射的联合作用,发现AS10组肿瘤细胞的辐射敏感性在相同剂量点处,较NS组和单纯照射组都显著提高(P<0.01),在低剂量区更加明显。而NS组与单纯照射组肿瘤细胞的辐射敏感性无显著差异。表明反义STAT3够提高辐射对肿瘤细胞的杀伤能力,提高了肿瘤的辐射敏感性,特别在低剂量区提高的更为显著,具有明显的临床研究意义。通过凋亡形态学观察及早期凋亡的检测,我们发现A549细胞具有很强的辐射抗性,单纯照射16 Gy时,仅对其有一定程度的增殖抑制效应,未见有典型的凋亡形态的细胞出现,单纯照射12Gy时,早期凋亡率也仅有9.33%,而AS10转染联合辐射后,Hoechst33258染色荧光显微镜下可见细胞核分布较为稀疏,有较多典型凋亡形态的细胞,流式检测早期凋亡发现,AS10联合辐射组的凋亡率较单纯照射组和NS联合辐射组有显著提高,在12Gy联合AS10转染时,早期凋亡率达到57.93%。因此,高效反义STAT3寡核苷酸能够抑制A549的增殖和促进其凋亡,增加肿瘤细胞的辐射敏感性,有利于在较低的辐射剂量下杀死更多的肿瘤细胞。其机制一方面是反义STAT3寡核苷酸阻断细胞中STAT3信号通路后,其下游的多种基因表达受到调控,发生了相应的变化,下调了其下游的抗凋亡基因Bcl-xL等,促进了凋亡的发生,加上电离辐射对细胞凋亡的诱导作用,两者联合应用产生了协同叠加的效应,增加了辐射抗性肿瘤的辐射敏感性。另一方面是反义STAT3下调了细胞周期控制基因,如CyclinD1等,加之辐射导致的DNA损伤,使细胞不能通过G1期的检查点,发生周期阻滞,进而对肿瘤细胞进一步产生了增殖抑制效应。由于已有报道说阻断STAT3对正常的细胞生长的几乎没有影响,因此,靶向STAT3蛋白在辐射增敏领域的研究可能具有比较乐观的临床前景,进一步相关机理及体内的实验研究正在开展之中。
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