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鱼类肌肉发育及成肌因子的进化

作　者: 谭训刚
导　师: 张培军；杜少军
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物
关键词: 斜纹鲈 Myf-5 myogenin 真鲷 MyoD 文昌鱼 AmphiMyoD 斑马鱼启动子 Bop
分类号: S917
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

本文主要研究了肌肉发育过程中 Hedgehog信号系统中转录因子Gli2 部分蛋白的制备,纯化以及抗体的制备;鱼类肌肉发育-分化过程内转录因子的特性,以及通过比较文昌鱼的 MyoD 基因进行其进化的分析。并利用酵母双杂交的方法分离到一个对肌肉发育-肌肉分化和成熟过程起关键作用的基因。并对这些基因的启动子的特性进行了分析。实验中制备得到一个可溶性的蛋白-Gli2N2 蛋白。利用该蛋白注射兔子,得到一个可以检测异位表达的 Gli2 蛋白的抗体。利用该抗体分析了异位表达的 Gli2 的时间图式。在 12hpf 时,外源表达的 Gli2 主要以全长存在,而从 15hpf 以后 Gli2 蛋白以缺失 C-端序列的蛋白出现。这是第一个得到的抗 Gli2 抗体;也是第一次用抗 Gli2 的抗体分析外源的 Gli2 蛋白表达。从斜纹鲈中分离到 Myf-5 和 myogenin 基因,特征分析表明它们和其它种属的生肌因子-MyoD 家族内基因含有相同的结构:三个外显子和两个内含子。从真鲷中分离到两个 MyoD 基因,它们在真鲷中的表达图谱有不同,其中 MyoD1 的表达受 Hedgehog 的影响。通过和其它种属的 MyoD 基因比较研究 MyoD 基因的进化,结果表明这两个MyoD 可能是由独立的复制产生的或者在进化的过程中整个基因组很有可能发生了复制,而在某些种属内一个 MyoD 基因丢失。上述 MyoD 家族基因的成员的启动子可以驱动报告基因 GFP 在斑马鱼胚胎肌肉中特异性表达。这表明这些启动子中含有调节肌肉特异性表达的元件;并且这些元件可以在不同种属中保守以及跨越种属起作用。在进化中,头索动物文昌鱼被认为是接近于脊椎动物的活化石。我们从文昌鱼中分离到一个 MyoD 家族的基因 AmphiMyoD。序列分析表明 AmphiMyoD 与脊椎动物以及无脊椎动物的生肌基因比其它三个早已公布的 MyoD 类似基因更有同一序列。这些数据表明 AmphiMyoD 可能更接近于进化过程中产生四个生肌基因的原始生肌基因。并且,在系统发育分析中文昌鱼中的四个生肌基因独自形成一组而不是分别成为脊椎动物的 MyoD 家族四个基因组中的一位,这表明在文昌鱼中产生多个生肌基因的基因复制与脊椎动物中产生四个生肌基因的基因复制没有关联。其启动子可以驱动报告基因 GFP 在斑马鱼胚胎骨骼肌以及心肌中特异性表达。这表明控制肌肉特异性表达的元件在进化中保守,这些元件可以跨越种属起作用;而且我们发现其在心肌中的表达也是非常有趣的。用酵母双杂交得到的 Bop 基因在斑马鱼中通过不同的剪切拼接产生至少两种形式。实验分析表明 Bop 特异性地表达在斑马鱼胚胎发

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
引言  10-44
  胚胎肌肉发育  10
  鱼类肌肉发育  10-12
  特化信号  12-30
    Hedgehog 信号系统  12-25
      Hedgehog 蛋白的生化研究  15-16
      Hedgehogs 的表达和功能  16-18
      Hh信号的传导  18-25
    肌肉发育中的Wnt 信号  25-27
    TGF- β信号传导  27-29
      Pax  28-29
      Calcineurin  29
    NFAT信号的控制  29-30
  分化信号  30-44
    MyoD家族基因的功能  30-32
    MyoD 家族启动子中的调节元件  32-34
    Myogenesis 的负调控  34-37
      Id  34-35
      Twist  35
      MyoR 和mist-1  35
      ZEB  35-37
    Myogenesis 的正调节子  37-39
      一般的转录因子  37-38
      核激素受体  38-39
    转录后调控  39-40
      磷酸化-去磷酸化调控  39-40
      肌肉基因表达的辅激活因子和MyoD的乙酰化  40
    染色体重排  40-41
    MyoD 蛋白的稳定化，泛素化，以及降解  41
    细胞循环的控制  41-42
      P21  41
      E2F  41-42
    成肌因子的进化  42
    肌细胞成熟  42-44
第一章.斑马鱼Gli2 蛋白表达；抗体的产生以及在斑马鱼胚胎中的分析  44-63
  简介  44-45
  材料和方法  45-50
  结果  50-62
    比较斑马鱼的Gli2 与果蝇的Ci  50-51
    亲水/疏水性的决定  51-53
    构建带有his-标记的重组蛋白以及Myc-标记的蛋白的质粒  53
    重组蛋白的产生  53-54
    诱导物IPTG 对重组蛋白量的影响  54
    时间对重组蛋白产生量的影响  54-55
    重组蛋白的可溶性以及其与亲合柱结合效率  55-56
    TnT –体外转录翻译系统确定构建质粒的阅读框架  56-57
    构建不同启动子驱动的Gli2  57
    通过外源表达Gli2 分析抗体  57-58
    Western 杂交分析外源表达的Gli2 时间过程  58-59
    抗体纯化  59-62
  讨论  62-63
第二章条纹鲈鱼（Striped Bass）肌肉调节因子Myf5 和Myogeni的特性以及肌肉特异性启动子的分析  63-78
  简介  63-64
  材料和方法  64-66
  结果  66-69
    从条纹鲈中分离Myf5 和myogenin基因以及其测序  66
    条纹鲈Myf5 和myogenin 的序列分析以及其特征  66-67
    Myf5 的GFP 及myogenin 的GFP转基因质粒的构建---  67
    条纹鲈Myf5 以及myogenin启动子在斑马鱼中驱动肌肉特异性GFP 表达  67-68
    条纹鲈和斑马鱼的Myf-5 和myogenin启动子的比较  68
    比较斑马鱼和条纹鲈的Myf-5和myogenin基因组序列  68-69
  讨论  69-78
第三章：真鲷(Sparus aurata) 快肌和慢肌两个MyoD基因的不同表达  78-103
  简介  78-80
  材料和方法  80-85
  结果  85-103
    分离真鲷的MyoD1 和MyoD2 基因组序列  85
    基因组序列分析  85
    外显子/内含子交界的确定  85
    蛋白序列分析  85-86
    构建MyoD1-GFP 和MyoD2-GFP 质粒  86
    forskolin 处理真鲷胚胎条件的确定  86-87
    原位杂交研究真鲷中MyoD1和MyoD2时间及空间表达  87-88
    通过RT-PCR 检测MyoD1和MyoD2在真鲷胚胎，以及成体中慢肌以及快肌的分布  88
    Forskolin 抑制MyoD1 在真鲷胚胎的近轴层细胞的表达  88
    真鲷MyoD1 和MyoD2 的启动子在斑马鱼胚胎中驱动肌肉特异性GFP表达  88-103
第四章：文昌鱼(B. belcheri)中一个新的MyoD基因的进化方向以及其启动子在骨骼肌和心肌中的特异性  103-120
  简介  103-104
  材料和方法  104-106
  结果  106-109
    从文昌鱼(B. belcheri)基因组中分离出一个新的MyoD基因并测序  106
    通过3’RACE 分离文昌鱼AmphiMyoD 基因的cDNA并测序  106
    基因组序列以及cDNA序列分析  106
    构建AmphiMyoD-GFP 质粒  106-107
    文昌鱼(B.belcheri)基因组中含有多个MyoD-类似基因  107-108
    文昌鱼MyoD 基因的启动子驱动GFP在斑马鱼胚胎的骨骼肌和心肌中表达  108-109
  讨论  109-120
第五章：利用酵母双杂交系统通过蛋白质互作筛选影响靶基因活性的基因以及Bop在斑马鱼骨骼肌，心肌中的表达和功能特性  120-158
  简介  120-122
  实验材料和方法  122-125
  结果  125-153
    pBD-FLH and Cs-MT-FLH 质粒的构建  125
    pAD-cDNA 噬菌粒文库的制备  125-126
    利用酵母双杂交分类系统分离基因  126
    利用双杂交系统验证蛋白－蛋白相互作用  126-128
    序列分析  128
    通过TnT 和Co-IP分析Vox和FLH蛋白之间的反应---  128-129
    分离并分析斑马鱼Bop1 和Bop2 的序列  129-132
    蛋白序列分析比较不同种属Bop基因蛋白序列  132-135
    原位杂交分析斑马鱼Bop1 和Bop2 在胚胎中的时间和空间的表达  135-136
    RT-PCR 分析Bop在斑马鱼胚胎中的时间表达  136-137
    Hedgehog 信号系统是维持Bop细胞表达需要的  137-139
    Bop 染色体定位  139
    MO 设计  139-142
    分离Bop基因的启动子，构建Bop-GFP  142-144
    构建不同的表达质粒  144
    Bop 基因启动子驱动肌肉特异性表达GFP  144-145
    MO:Bop-E818 降低Bop的表达  145-147
    降低m Bop的表达没有生肌细胞的特化  147-149
    降低m Bop的表达抑制成肌细胞的分化  149-150
    降低Bop的表达通过翻译抑制物MO:Bop-ATG  150
    证实专一性降低Bop基因表达  150
    m Bop1 和mBop2 的作用是相互重叠  150-151
    在mBop表达降低出现的表型不是由于运动神经缺陷造的  151-152
    在斑马鱼胚胎中异位表达Bop  152
    异位表达Cs~(2+)-MT-Bop m RNA出现的表型  152-153
  讨论  153-158
参考文献  158-190
结论  190-191
发表文章  191-192
致谢  192

鱼类肌肉发育及成肌因子的进化

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