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1.糖皮质激素受体拮抗剂RU486导致大鼠腹腔巨噬细胞易感化及其机制 2.糖皮质激素诱导细胞内PKCα蛋白增多的机制

作　者: 朱晓燕
导　师: 徐仁宝；卢建
学　校: 第二军医大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 糖皮质激素糖皮质激素受体易感化巨噬细胞蛋白激酶C应激一氧化氮细胞内游离钙离子浓度 RNA干扰免疫印迹表达载体荧光素酶报告基因检测逆转录-聚合酶链式反应全身炎症反应综合症多器官功能障碍综合症
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

我们实验室以往的研究发现，应激、全身炎症反应综合症（systemetic inflammatory response syndrome，SIRS）、多器官功能障碍综合症（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）时糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor,GR）特异结合明显减少，且病情越重，GR特异结合减少的幅度越大，进一步研究发现预先给大鼠注射RU486阻断GR后再给予内毒素或放血，则大鼠的炎症变化明显加重，因此本实验室范杰、徐仁宝等提出GR结合降低，体内抗炎机制减弱可能是SIRS、MODS发生的一个机制。作者认为这结果还提示注射RU486可能使机体的白细胞处于易感状态（priming state），使得机体对“第二次打击”的抵抗力下降。为证明这一点，本论文第一部分的工作首先利用注射RU486导致GR阻断的大鼠模型，选择炎症介质一氧化氮（nitric oxide，NO）为指标，观察腹腔巨噬细胞是否处于易感状态。结果发现注射RU486大鼠腹腔巨噬细胞12h内生成NO的基础量以及用脂多糖（LPS）处理12h后所生成NO的量均明显高于对照大鼠，说明注射RU486大鼠腹腔巨噬细胞确实处于易感状态。白细胞易感化的机制非常复杂，不同的刺激因素导致不同的细胞易感化的机制各不相同。已有的研究结果提示G蛋白活化、磷脂酶D（PLD）活化、[Ca²⁺]i升高及酪氨酸激酶活化等都可能与白细胞易感化有关。作者前一阶段的研究表明蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和[ca²⁺]i在机体的易感化中起着重要作用，因此本论文重点研究了注射RU486引起的巨噬细胞的PKCα和[Ca²⁺]i的变化。结果发现注射RU486大鼠腹腔巨噬细胞的[Ca²⁺]i和PKCα蛋白均明显高于对照大鼠。以往的实验表明注射RU486阻断GR的同时，还使大鼠体内的糖皮质激素（glucocorticoid，GC）显著增高。因此本文采用单侧肾上腺切除（Adx1）注射RU486的模型（本实验室的前期工作表明给Adx1大鼠注射RU486能够显著降低注射RU486引起的血浆GC浓度的升高），进一步探讨GR阻断和GC在巨噬细胞易感化过程中的作用。结果显示Adx1不同程度地降低了注射RU486大鼠PM的NO生成量和[Ca²⁺]i增多的水平，同时可使PKCa增多完全逆转，提示血第孟军医大学博士李位论式朱晓庆浆GC升高不同程度地参与了注射RU486导致大鼠PM易感化的过程。此外在注射RU486导致GR阻断近90%的条件下，血清中GC浓度下降同时伴随着腹腔巨噬细胞PKCa蛋白的减少，提示GC有GR非依赖性升高PKCa的作用。考虑到肾上腺分泌多种激素，肾上腺切除必然也影响到其他激素的血清浓度，因此我们又在体外研究了GC和GR阻断对小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7的No生成、IC扩+]i和PKc蛋白的影响。结果发现Gc能够抑制RAW264.7细胞生成NO，RU486可以完全逆转GC的这种作用，而在同样浓度的RU486作用下，不同浓度GC对RAW264.7细胞生成NO的作用没有明显差异，说明GC对NO生成的抑制完全通过GR的介导。此结果还提示在体实验中注射RU486大鼠腹腔巨噬细胞NO生成增多主要是由于在生理状态下血浆中的GC通过GR的介导起着抑制NO生成的作用，而GR阻断则抑制了GC的这种作用，从而使巨噬细胞生成NO增多。而Adxl不完全逆转注射RU486大鼠NO生成增多的作用则可能是由于Adxl时除GC外的其他因素的变化所引起的。实验结果还表明地塞米松（dexamethasone，Dex）能够诱导RAW264.7细胞[CaZ+]i升高，而RU486不能完全阻断Dex的这一作用。Dex和皮质酮（eortieosterone，B）均能诱导RAW264.7细胞内PKCa增多，且呈明显的剂量一效应关系，而RU486并不能阻断Dex诱导细胞内PKC。升高的作用，提示这一作用与GR无关。以上结果说明注射RU486导致大鼠巨噬细胞易感化的机制至少部分地是由oe增高（使[CaZ+]i和pKCa升高）和GR特异结合降低（使NO生成增多）共同作用的结果。由于注射RU486引起的GC和GR的变化与应激时变化是一样的，因此可以对本实验室范杰、徐仁宝等于1994年所提出的应激时由于GR特异结合降低，抗炎机制减弱，从而加重SIRS、MODS的假说作如下的补充:应激、特别是严重损伤时，GC分泌增加，使「CaZ+]i和PKCa升高，与此同时GR特异结合降低，抗炎机制减弱，使NO等炎症介质的生成增加，二者的协同作用使白细胞易感化，甚至使白细胞活化;在此基础上，如再遭受感染、出血等“第二次打击”，就容易发生SIRS、MODS，或使其加重。由于RU486并不是非常专一的GR拮抗剂，它同时也是孕激素受体的拮抗剂，因此我们进一步利用RNA干扰技术，观察GC对内源性GR表达knock down的RAW264.7细胞中PKCa蛋白表达的影响。我们首先设计了两段特异性针对第二军医大学博士学位论次朱晓及GR的siRNA（small inierferenee州A）序列并构建了它们的表达载体psileneer1.0一U6一GRI和2，分别转染RAW264.7细胞后，用Rl’- PCR、W亡stem blot以及GR报告基因检测的方法鉴定，结果发现其中psilencer 1 .0一u6一GRZ能够有效地阻断GR表达。进一步我们将这段序列克隆到siRNA稳定表达载体psileneer2.1一U6并建立了稳定的GR灿ockdo帅的 RAW264.7一GR（一）细胞系。用GC分别处理psileneer 1 .0一U6一GRZ瞬时转染的RAW264.7细胞和RAW264.7一GRC)后，结果发现在内源性GR?

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Abbreviations  3-4
中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
第一部分糖皮质激素受体拮抗剂RU486导致大鼠腹腔巨噬细胞易感化及其机制  11-33
第二部分 GC增加细胞内PKCα蛋白的机制  33-56
参考文献  56-63
附录1 GC逆转内毒素耐受及其机制  63-68
附录2 Knockdown of glucocorticoid receptor expression by RNA interference promotes cell proliferation in murine macrophage RAW264.7cells  68-84
综述内毒素耐受及其分子机制  84-95
致谢  95

1.糖皮质激素受体拮抗剂RU486导致大鼠腹腔巨噬细胞易感化及其机制 2.糖皮质激素诱导细胞内PKCα蛋白增多的机制

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