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中国部分甲肝病毒流行株结构蛋白VP3-VP1区基因特点分析及TaqMan Realtime PCR法定量检测甲型肝炎病毒核酸

作　者: 郑惠惠
导　师: 曹经瑗
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 免疫学
关键词: 甲型肝炎病毒 序列分析 逆转录聚合酶链式反应
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的急性传染病。甲肝的流行与社会、经济和卫生情况有很大关系。通过卫生条件的改善及疫苗的使用,中国的甲型肝炎暴发近年来有所下降,但甲型肝炎病毒仍然是导致急性病毒性肝炎的主要原因之一。甲肝主要通过粪口途径传播,食用污染的食物或水可以引起甲肝的暴发。通过对甲肝散发或暴发中得到的HAV病毒株的序列进行基因分型研究及序列同源性分析,能够为甲肝溯源研究提供有力的技术和理论支撑。迄今HAV只有一种血清型,其中和抗原位点氨基酸序列高度保守。研究表明中和抗原位点主要位于HAV结构蛋白VP1及VP3区,中和抗原位点变异有可能产生免疫逃逸株。目前国内外科学家根据VP1-2A连接处序列进行了大量HAV基因分型工作,我们的基因分型研究也表明我国有多株HAV病毒株流行,但全长结构蛋白VP3-VP1区特别是中和抗原位点处的核苷酸及氨基酸变异值得进一步研究。本研究对2005-2008年收集于中国宁夏、河南、河北、新疆部分城市的HAV流行株的结构蛋白VP3-VP1区基因特点进行了分析。对收集到的急性甲肝病例的抗HAV IgM阳性血清经核酸(RNA)提取、逆转录及巢氏PCR,得到42份样本的结构-非结构蛋白VP3-VP1-2A区序列,进行序列同源性比较并分析其基因特点。系统进化树分析显示42株病毒株均属于Ⅰ型,40株是ⅠA亚型,2株ⅠB亚型。通过对各病毒株的核酸及氨基酸序列的同源性进行分析得到,42株HAV病毒株在VP1-2A连接处核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.1%～100%和97.3%～100%；在全长结构蛋白VP3-VP1区的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.6%～100%和98.8%～100%。本研究中VP1-2A连接处序列相同的病毒株在全长结构蛋白VP3-VP1区的核苷酸同源性为98.4%～100%,0-2个氨基酸位点不同。说明VPl-2A结合处核苷酸序列相同的分离株在全长结构蛋白VP3-VP1区核苷酸序列相同或相近,氨基酸序列保守。揭示其亲缘关系很近。同时本实验所得序列在已发表的各中和抗原位点处氨基酸序列均未变异。本实验在基因分型研究的基础上,对中国部分HAV流行株全长结构蛋白VP3-VP1区基因特点进行分析,确定其氨基酸序列特别是中和抗原位点的高度保守性,为进一步研究甲肝的分子流行病学提供了基础。实时荧光定量PCR方法是近些年发展起来的一种成熟的病原检测方法,该方法具有特异性强,灵敏度高,重复性好等优势,通过对扩增产物的实时监测,定量分析样本中的病原核酸。使用实时定量PCR以快速检测样本中的HAV核酸及定量分析对深入研究甲肝发病机理、分子流行病学研究等有重要意义。本研究根据参考文献选择特异性扩增5’NCR保守区的引物和探针,建立了TaqMan Realtime PCR方法,并进行了初步应用。本研究以梯度稀释的体外转录的RNA为标准品制作标准曲线,用绝对定量的方法检测急性期甲肝病人血清及减毒活疫苗样品中的HAV核酸。通过使用已知阳性样本对本研究建立的TaqMan Realtime PCR方法的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行分析。结果显示其检测灵敏度为10个拷贝/反应,特异性好,非HAV样本没有阳性扩增；6个浓度的RNA标准品样本重复检测3次,批内样本的Ct值的变异系数最大值为2.0%,批间样本的Ct值的变异系数最大值为2.6%,揭示其良好的重复性和稳定性。根据Ct<36,作为阳性样本的判断标准,本研究中得到HAV阳性样本87份,其血清中的HAV病毒浓度为5.18×102-4.93×107拷贝/m1。其中部分处于治疗期(7-50天)的样本,其血清中HAV病毒浓度为5.18×102-2.5×104拷贝/m1。使用减毒活疫苗做为样本,本研究建立的体系可以检测到0.03TCID50,而普通逆转录及巢氏PCR检测的灵敏度为0.1TCID50。通过计算得到1TCID50约为3.3×102个拷贝的病毒量。本研究初步建立了一种TaqMan Realtime PCR检测HAV核酸的方法,并初步应用于定量检测血清及减毒活疫苗中的HAV核酸。这种方法灵敏度高,重复性好,为快速及定量检测HAV核酸提供了技术支持,对甲肝预防和控制工作有重要意义。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-10
第一部分 中国部分甲肝病毒流行株结构蛋白VP3-VP1区基因特点分析  10-30
  前言  10-11
  实验材料与方法  11-17
    实验材料  11-13
    实验方法  13-17
  实验结果  17-27
  讨论  27-29
  小结  29-30
第二部分 TaqMan Realtime PCR法定量检测甲型肝炎病毒核酸  30-52
  前言  30-32
  实验材料与方法  32-41
    实验材料  32-34
    实验方法  34-41
  实验结果  41-49
  讨论  49-51
  小结  51-52
参考文献  52-54
综述  54-62
  参考文献  58-62
致谢  62-63
附录  63-88

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学
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