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基因枪接种HBs DNA疫苗诱生Th2型免疫应答的机理及促进其向Th1型转换的研究

作　者: 周晓辉
导　师: 袁正宏
学　校: 复旦大学
专　业: 病原生物学
关键词: DNA 疫苗基因枪危险信号佐剂 pG 结构 HBV Core
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

DNA 疫苗因可克服传统疫苗的缺陷、同时诱发机体产生细胞及体液免疫应答,并具有制备简单、稳定等优点,被认为是未来疫苗发展的一个新方向,而近几年兴起的基因枪接种 DNA 疫苗因具有只需微量的质粒 DNA 就能诱发很强免疫反应等特点在人体免疫中可能具有极大的应用前景。然而许多研究显示,与注射器肌注或皮内注射主要诱生 Th1 型免疫应答相比,基因枪接种 DNA 疫苗所诱生的免疫应答以 Th2 型为主,迄今尚不清楚这种差异的机制。鉴于 Th1 型免疫应答在清除病毒持续性感染、抗胞内菌感染和抗肿瘤免疫中的重要作用,了解基因枪和注射器接种 DNA 疫苗诱生不同类型免疫应答的分子机制以及寻找增强基因枪接种 DNA 疫苗诱生 Th1 型免疫应答的佐剂策略,已成为国内外众多学者关注的焦点。本课题以乙肝表面抗原(HBsAg)为靶抗原,对基因枪皮肤接种 HBsDNA 疫苗诱生 Th2 型免疫应答的机理进行探讨,并试图寻找能促使其向 Th1 型转换的佐剂策略。 DNA 疫苗以基因枪和注射器接种可能在以下几方面存在差异,包括接种剂量、质粒 DNA 的转染机制、局部抗原递呈细胞(APC)的种类、抗原加工呈递的过程等。鉴于 APC(特别是树突状细胞)的活化对免疫应答的诱生及性质有重要影响,推测基因枪与注射器接种对 APC 产生不同“危险信号”(在基因枪由金颗粒轰击造成,在注射器接种则为质粒 DNA 中所含的 CpG motif)可能是诱生不同类型免疫应答的关键。为验证此 “危险信号”假说,本研究首先对基因枪皮肤接种与注射器肌注接种后 BALB/c 小鼠的局部组织作 H&E 染色观察,结果表明基因枪接种轰击金颗粒与注射器肌注接种 CpG motif 均可在局部诱发炎症,证实二者均为可激活机体天然免疫反应的“危险刺激”。为探讨两种“危险刺激”对免疫应答类型影响的可能机制,对 BALB/c 小鼠分别以基因枪皮肤接种质粒 1<WP=5>博士学位论文中文摘要DNA+金颗粒、单独金颗粒或 CpG-ODN+金颗粒,注射器肌注接种质粒 DNA、CpG-ODN 或 GC-ODN,接种 3 小时、6 小时、12 小时、24 小时与 48 小时后分离引流淋巴结细胞,体外培养加 ConA 刺激,进而以 RT Real-Time PCR 方法检测各组细胞释放 IFN-γ、IL-12、IL-10 或 IL-4 的水平。结果表明:基因枪接种 1μgDNA 疫苗可在引流淋巴结造成 Th2 型细胞因子微环境;注射器接种 100μgDNA疫苗可在引流淋巴结造成 Th1 型细胞因子微环境;注射器接种 25μg CpG-ODN也能在引流淋巴结造成 Th1 型细胞因子微环境;基因枪单独轰击金颗粒即能在引流淋巴结造成 Th2 型细胞因子微环境;基因枪轰击金颗粒+25ug CpG-ODN 则能改变引流淋巴结 Th2 型细胞因子微环境。根据以上研究结果,可以推测基因枪轰击金颗粒可能造成一种 Th2 偏性的“危险信号”,接种 HBs DNA 疫苗时因所含的CpG motif 太少不足于发挥 Th1 型免疫佐剂的作用,因而不能改变其 Th2 偏性的环境,由此导致基因枪皮肤接种 HBs DNA 疫苗诱生 Th2 型免疫应答;上述研究结果也提示增加 CpG-ODN 用量可改变基因枪接种所产生的 Th2 偏性的微环境、使其转化为 Th1 型。为佐证基因枪轰击金颗粒能刺激机体细胞释放内源性的“危险信号”,进一步用透射电镜对基因枪轰击后金颗粒在皮肤组织细胞的分布进行了观察,结果显示基因枪轰击后金颗粒可进入细胞内,有的甚至直接导入到细胞核,这可能会对机体细胞造成一个应急状态从而释出某些具有免疫调节作用的物质。为克服基因枪接种 DNA 疫苗诱生 Th2 型免疫应答为主的缺点,本研究进一步对可能促使基因枪接种HBs DNA疫苗诱生的Th2型免疫应答向 Th1型转换的佐剂策略进行了探讨。已知 CpG motif 能激活 TLR9 信号通路而促进 Th1 型免疫,基于用基因枪轰击金颗粒+CpG-ODN 能使引流淋巴结细胞因子微环境转化为Th1 型的结果(本研究第一部分),推测在基因枪接种 HBs DNA 疫苗的同时共导入一定量的 CpG-ODN 有可能克服其 Th2 型的偏性。实验证明,用基因枪共导入10μg CpG-ODN 和 1μg 质粒 pYQF-2CpG/s 能促使针对 HBsAg 的 Th2 型免疫应答向 Th1 型转化,包括提高 IgG2a 水平、IgG2a/IgG1 比值、增强特异性 CTL 活性以及抗原特异的 IFN-γ 释放能力。CpG-ODN 与质粒 DNA 的比例对其佐剂效果有一定影响。根据单链 RNA 能激活 TLR7 或 TLR8 信号通路而促进 Th1 型免疫以及HBcAg 诱生 Th1 型免疫应答的能力与其 C 末端结合 RNA 的性能有关的研究报道,本研究进一步对 HBcAg 结合 RNA 的特性作为一种 Th1 佐剂策略的可能性进行了分析。实验证明共导入或共表达全长 HBV core 基因能使基因枪接种 HBsDNA 疫苗所诱生的针对 HBsAg 的 Th2 型免疫应答转化为 Th1 型,表现在抗HBsAg IgG2a 水平升高、IgG2a/IgG1 比值反转,HBsAg 特异性 CTL 活性与 2<WP=6>博士学位论文中文摘要IFN-γ 释放能力增强。通过上述研究,本文验证了基因枪轰击金颗粒可造成一种 Th2 偏性“危险信号”的假设,并证实提高 CpG moitif 数量可使其向 Th1 型转换,部分?

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
前言  10-12
第一部分基因枪接种 HBs DNA 疫苗诱生 Th2 型免疫应答的机理研究  12-31
  引言  12-13
  材料与方法  13-18
  结果  18-28
  讨论  28-30
  结论  30-31
第二部分促进基因枪接种 HBs DNA 疫苗诱生的 Th2 型免疫应答向 Th型转换的研究  31-61
  1 以 CpG ODN 为佐剂促进基因枪接种 HBs DNA 疫苗诱生的 Th2 型免疫应答向 Th1 型免疫应答转换  31-43
    引言  31
    材料与方法  31-37
    结果  37-41
    讨论  41-43
  2 以 HBVcore 基因为佐剂促进基因枪接种 HBs DNA 疫苗诱生的 Th2 型免疫应答向 Th1 型免疫应答转换  43-61
    引言  43
    材料与方法  43-51
    结果  51-59
    讨论  59-61
第二部分小结  61-62
参考文献  62-71
论文总结及创新点  71-73
文献综述免疫“危险信号”学说及其医学实践意义  73-82
附录  82-84
致谢  84-85

基因枪接种HBs DNA疫苗诱生Th2型免疫应答的机理及促进其向Th1型转换的研究

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