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vgbM基因在植物中的表达及抗虫棉GK12中外源基因整合的初步分析

作　者: 崔洪志
导　师: 郭三堆
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: VgbM基因增产烟草抗虫棉花整合边界序列
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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引　用: 5次
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内容摘要

常规的栽培及育种技术使粮食产量再上一个大的台阶难度很大。面对人多地少的矛盾，解决未来我国粮食安全问题必须依靠一次新的农业科技革命，也就是转基因农作物的产业化。在转基因农作物的研究中，人们至今仍对外源基因与植物基因组整合的机制所知有限，尤其针对具有我国特色的花粉管通道法遗传转化机理的相关研究更少。本研究在我国转基因抗虫棉研究的基础上，一方面，进行了透明颤菌血红蛋白基因转基因植物的研究，分析了其在增产转基因作物研究方面的作用；另一方面，对抗虫棉GK12中杀虫基因的整合进行了初步分析，对于进一步揭示花粉管通道遗传转化的机理、改进并提高转化效率以及尝试通过同源重组实现定位整合的研究等方面都具有积极的意义。根据透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列，按照植物偏爱密码子，人工设计合成了vgbM基因，并成功构建了植物表达载体pGBI4ASVHB。在对通过农杆菌介导法获得的转基因烟草的研究中发现：该基因的表达可增加烟草的生长量，并促进提早开花和增加花量，叶绿素含量增加23.4％。进一步构建了vgbM和GFM Cry1A Bt双价基因植物表达载体pGBI4ABV，通过花粉管通道法导入棉花，获得了转双基因的7个株系。转基因棉花在表现对棉铃虫显著抗性的同时，还发现其萌发速度较快，叶绿素含量平均增加13％左右，花期明显提前，结铃数显著增加。本研究首次报道了转透明颤菌血红蛋白基因的棉花在增产和抗涝性提高两方面具有作用，并注意到了叶绿素含量测定可作为检测vgbM基因表达的指标，为进一步获得增产转基因农作物提供了研究基础。本研究还通过改进的基于单链及巢式PCR的染色体步移方法，对通过花粉管通道法转化获得的抗虫棉GK12中杀虫基因整合的旁侧序列进行了分析。结果发现：整合在棉花基因组中的杀虫基因表达盒和其它外源DNA片段发生了串联重组，支持了外源基因整合的“两步整合机制”模型。并发现了整合过程有拓扑异构酶和转座作用参与的分子证据；同时证明了构建在普通质粒上的外源基因可以通过花粉管通道法成功转化植物。暗示了不包括载体骨架的外源基因表达盒片段直接转化作物是可行的。这对于提高转基因植物的安全性具有一定的意义。更重要的是，没有载体骨架序列的干扰对于通过同源重组实现外源基因在植物中的定位整合(基因打靶)也是有利的。利用整合旁侧序列分析的结果，结合影响外源基因表达的已知相关因素，直接将外源目的基因定位整合到‘稳定高表达’位置，可简化转基因农作物研究中的筛选鉴定程序，建立无载体参与的外源基因片段植物转化新模式。无疑对于促进转基因农作物的研究和产业化具有重要意义。

全文目录

第一章绪论  12-44
  1.1 Bt抗虫基因及其转基因农作物的研究进展  13-24
    1.1.1 Bt杀虫蛋白及其基因  13-14
    1.1.2 Bt杀虫晶体蛋白的结构  14-21
    1.1.3 Bt制剂的应用及存在的主要问题  21-22
    1.1.4 Bt转基因抗虫农作物研究  22
    1.1.5 昆虫对Bt蛋白产生抗性的问题  22-24
  1.2 血红蛋白的研究进展  24-34
    1.2.1 动物中的血红蛋白  24-25
    1.2.2 植物中的血红蛋白  25-29
    1.2.3 透明颤菌血红蛋白VHB(Vitreoscilla sp.Hemoglobin)的研究  29-31
    1.2.4 血红蛋白基因的演化  31-34
  1.3 转基因植物中有关外源基因整合的研究现状  34-42
    1.3.1 植物转化过程中外源基因进入植物细胞的机制  34-37
    1.3.2 植物遗传转化过程中外源基因的整合研究  37-40
    1.3.3 外源基因整合和稳定表达的关系  40-42
  1.4 本研究的目的和意义  42-44
    1.4.1 vgbM转基因植物的研究  42
    1.4.2 抗虫棉中杀虫基因整合的初步分析  42-44
第二章透明颤菌血红蛋白基因在烟草中的表达研究  44-65
  2.1 材料和方法  44-53
    2.1.1 试验材料  44-46
    2.1.2 方法  46-53
  2.2 结果和分析  53-64
    2.2.1 vgbM基因的设计合成及克隆  53-58
    2.2.2 vgbM基因在烟草中的表达分析  58-64
  2.3 小结  64-65
第三章 vgbM基因在转基因抗虫棉中的表达研究  65-86
  3.1 材料和方法  65-71
    3.1.1 试验材料  65-66
    3.1.2 方法  66-71
  3.2 结果和分析  71-84
    3.2.1 vgbM、GFM CrylA Bt双基因植物表达载体的构建  71-72
    3.2.2 vgbM转基因棉花的获得  72-75
    3.2.3 vgbM基因在T1代棉花中的表达分析  75-84
  3.3 小结  84-86
第四章抗虫棉GK12中杀虫基因整合初步分析  86-99
  4.1 材料和方法  86-90
    4.1.1 试验材料  86-88
    4.1.2 方法  88-90
  4.2 结果和分析  90-98
    4.2.1 GK12的遗传拷贝数分析  90
    4.2.2 基于单链PCR技术的侧翼DNA片段的克隆鉴定  90-92
    4.2.3 GK12中杀虫基因整合的侧翼序列初步分析  92-98
  4.3 小结  98-99
第五章结论和讨论  99-104
  5.1 结论  99
  5.2 讨论  99-103
    5.2.1 vgbM基因在植物中的表达研究  99-101
    5.2.2 GFM CrylA抗虫棉中杀虫基因整合的分析  101-103
  5.3 本研究的创新点  103-104
参考文献  104-114
附录  114-126
致谢  126-127
作者简历  127-128

vgbM基因在植物中的表达及抗虫棉GK12中外源基因整合的初步分析

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