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恶性疟原虫四环素诱导性转基因表达系统的构建与检测

作　者: 王宪锋
导　师: 薛采芳
学　校: 第四军医大学
专　业: 病原生物学
关键词: 疟原虫恶性诱导表达四环素转基因
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

疟疾是一种重要的热带寄生虫病，尤其以恶性疟最为严重，每年死亡病例达200万之多。尽管人们在疟疾研究中已经做出了大量的不懈努力，但是全球有效的疟疾疫苗的出现还为时尚早。以往疟疾疫苗和药物的研究提示人们，只有更多、更深入的了解疟原虫的基础生物学相关信息才有可能尽快的战胜疟疾。近年来稳定的、可药物筛选的疟疾基因转染技术成为疟疾研究中一大突破，为深入阐明疟原虫基因结构与功能之间的关系奠定了技术基础。但是，不具有调节性的转基因表达系统对于一些虫体必需基因以及有生长抑制可能性或有毒性的基因功能的研究则无法进行。因此，疟疾研究中急需一种可调控的表达系统。基于四环素抑制子(Tetracycline Repressor，TetR)和四环素操纵子(Tet Operator，TetO)相互作用的四环素可诱导转基因表达系统，已经广泛的应用于很多真核生物，包括酵母、植物、昆虫、哺乳类细胞和诸如锥虫、阿米巴、贾第虫、弓形虫、利什曼和毛滴虫的寄生原虫。本文拟建立一种抑制型疟疾四环素可诱导转基因表达系统，为研究可能在疟疾预防与治疗中有重要作用的新基因打下基础。但是目前已有的诱导性启动子在疟原虫中不具有功能性，而疟原虫本身又没有诱导性启动子。为构建一个在疟原虫对四环素或其类似物具有可诱导性反应的重组启动子，将7个拷贝的TetO(7-Copy of TetO，7cot)插入到GBP130启动子单个转录起始位点(Transcriptional Initiation Site，TIS)附近。但由于在该TIS位点附近没有合第四军医大学博士学位论文适的限制性位点可用，首先利用重叠延伸PCR的方法在TIS上下游不同位点(即一5，一2，+2和+5)分别引入一个加m扭位点。以pTL一8为模板PCR扩增出7cot，然后利用其两端的Bg爪与Ba加川连接，分别构建4个反应载体，即pG/7T(一5)，pG/7T介2)，pG/7T(+2)和pG/7T(+5)。经pCR、限制性酶切和DNA测序分析表明构建完全正确。为鉴定7cot插入G刀尸j3口启动子后对启动子活性的影响，上述4个反应载体及其原始载体丙BPcATAZ分别用来电转环状体恶性疟原虫。CATELIsA检测表明，4个反应载体中的cAf表达水平均高于pGBPCAfAZ，并且7cot的定位越靠近下游CAT表达水平越高。说明7cot插入G召尸13口启动子后对启动子活性有促进作用，当7cot插入+5时启动子活性最高。因此，载体PG/7T(+5、可用于疟疾四环素可诱导转基因表达系统中的反应载体。为构建调节载体，PCR扩增TetR后克隆入质粒PD的单克隆位点召狡用Hl，其表达由伯氏疟原虫的二氢叶酸还原酶一胸普合成酶基因的5’和3’侧翼序列控制，构成载体pDT。反应载体和调节载体建成后，将PG/7T(十5)和PDT共转染疟原虫，以脱轻基四环素(Anhydrotetracychne，ATc)进行诱导，鉴定系统的诱导性。CAT检测表明，在Al七加入和不加入的转染组没有明显变化，即没有可调控性变化。为进一步提高报告基因的敏感性，以L乙/c置换pG/7T(+5)中的cAT，构成pGL(+5)，然后与pDT再次进行共转染。诱导剂AR的使用浓度分别为1林留mL、0.5抖留mL和0.1林留mL。LuC活性检测表明仍然没有发现可诱导性反应。推测可能是由于丁七仅的调控序列源于伯氏疟，在恶性疟中没有转录调控功能;或者是GBPI30启动子不适合于恶性疟的四环素可诱导系统;或者是其他可能的但是没有发现的因素。具体原因则有待进一步研究。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-14
文献回顾  14-29
  四环素可调控基因表达系统的研究进展  14-20
    1 工作原理  14-15
    2 基本组成  15-16
    3 发展改进  16-20
  寄生原虫的Tet可诱导表达调控系统  20-29
    1 锥虫  22-23
    2 阿米巴  23-24
    3 利什曼  24-26
    4 弓形虫  26-27
    5 贾第虫  27
    6 阴道毛滴虫  27-29
研究内容  29-64
  1 材料  29-37
    1.1 菌株  29-31
    1.2 载体  31-33
    1.3 试剂  33
    1.4 GBP130启动子序列  33-35
    1.5 引物  35
    1.6 原虫  35-36
    1.7 仪器  36-37
  2 方法  37-44
    2.1 在GBP130启动子中引入限制性位点  37-39
    2.2 pUC／KBN系列载体的构建  39
    2.3 pUC／7T系列载体的构建  39-40
    2.4 pG／7T系列载体的构建  40
    2.5 调节载体pDT的构建  40
    2.6 pGL系列载体的构建  40
    2.7 红内期疟原虫体外连续培养  40-41
    2.8 疟原虫同步化处理  41
    2.9 质粒的大量提取和纯化  41
    2.10 红内期疟原虫的转染  41-42
    2.11 转染虫体细胞抽提物的制备  42
    2.12 CAT活性的检测  42-43
    2.13 Luciferase活性的检测  43
    2.14 7cot的插入对GBP130启动子活性的影响  43
    2.15 脱羟基四环素虫体毒性分析  43
    2.16 瞬时转染系统诱导性的初步分析  43-44
  3 结果  44-54
    3.1 pUC／KBN系列载体的鉴定  44-46
    3.2 pUC／7T系列载体的鉴定  46-47
    3.3 pG／7T系列载体的鉴定  47-49
    3.4 7cot的插入对启动子活性的影响  49
    3.5 调节载体pDT的鉴定  49-50
    3.6 以CAT为报告基因检测系统诱导性  50-52
    3.7 pGL系列载体的鉴定  52
    3.8 疟原虫对ATc体外敏感性分析  52-53
    3.9 以LUC为报告基因检测系统诱导性  53-54
  4 讨论  54-62
    4.1 诱导性重组启动子的构建  55-57
    4.2 TetO元件对启动子的影响  57-58
    4.3 报告基因的检测  58-60
    4.4 四环素及其类似物的选用  60
    4.5 系统诱导性  60-62
  5 小结  62-64
参考文献  64-73
个人简历  73-74
发表主要学术论著  74-75
其他相关工作  75-76
致谢  76

恶性疟原虫四环素诱导性转基因表达系统的构建与检测

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