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嗜线虫致病杆菌杀虫蛋白的分离纯化及杀虫蛋白基因克隆

作　者: 王勤英
导　师: 李国勋
学　校: 河北农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 昆虫病原线虫 Xenorhabdus nematophila 杀虫毒素致病力 16S rDNA
分类号: S476
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌，包含两个属—Xenorhabdus和Photorhabdus，分别与Steinernematidae和Heterorhabditidae科的昆虫病原线虫互惠共生。二者联合可以侵染并快速杀死多种昆虫。通常共生菌依靠线虫将其携带进入寄主昆虫体内并释放到昆虫体腔中，共生菌在昆虫血腔内大量繁殖并产生杀虫毒素，导致寄主昆虫迅速死亡(约48h之内)。同时共生菌产生的抗生素抑制杂菌生长，为线虫生长、发育和繁殖提供理想的环境和合适的营养。昆虫病原线虫—共生菌复合体对昆虫具有的强致病力，共生菌在其中起着关键性作用。已有的研究表明许多共生菌不仅能产生血腔毒素，同时还能产生杀虫谱广、杀虫活性高的胃毒素。因此分离筛选高毒力的共生菌菌株、对其杀虫毒素及其杀虫基因进行深入研究，有助于发掘新的杀虫蛋白及杀虫基因，有可能为改变当前害虫防治和转基因抗虫植物的培育中杀虫蛋白或杀虫基因匮乏的局面开辟一条新的途径。本研究利用大蜡螟和黄粉虫土壤诱集法，从河北省各地的719份土样中的28份诱集到了昆虫病原线虫，有线虫率为3.89％。经初步鉴定25个为异小杆属线虫(Heterorhabditis)、3个为斯氏属线虫(Steinernema)。土样有线虫率与植被有关。以果园内最高，为8.64％，其次为菜地7.27％，杂草等未耕地为3.28％，大田作物为1.68％。通过取被感染大蜡螟血淋巴涂平板的方法，分别从这28个线虫品系中分离出28个共生菌菌株。对从河北省分离的28个菌株和4个本室保存的菌株的部分16S rDNA序列进行PCR扩增和测序，与共生菌已知种的同源序列进行比较分析，构建了系统进化树，初步确定了这32个共生菌的分类地位。这些菌株明显分成嗜线虫致病杆菌和发光光杆菌2个簇，区别Photorhabdus和Xenorhabdus两个属的DNA碱基差异在383和503的位置(E.coli numbering)，所有的Xenorhabdus为G和A，而所有的Photorhabdus为A和C。从河北省分离到的发光光杆菌大部分与P.luminescens关系密切，归属于三个亚簇。其中HB89和HBgy相似性达100％，二者与P.luminescens laumondii亚种相似性达99％。来自河北省的HBxhl、HBxh5、HB3、HB140、HB8、HB06、HB36、HB73、HB141、HB202、HB231、HB237、HB287、HB288、HB301和HB352菌株很有可能是P.luminescens中的新亚种或新种。GZ139与P.temperam相似性为100％，可能是该种的一个品系。D1菌株与已知的P.luminescens akhurstii亚种同源性很高，可能为同一亚种。HB310和HBml均为X.nematophila中的品系；gw15可能是Xenorhabdus中的一个新种。 HB310菌株的Ⅰ型菌与Ⅱ型菌部分16S rDNA序列的相似性是100％。但是HB310菌株的I型菌与n型菌的形态特点、生理生化指标测定及杀虫活性存在较大的差异。I型菌的胃毒活性和血腔活性远远高于n型菌。11型菌的蛋白组份发生了很大的变化，H型菌的native一PAGE蛋白图谱上没有发现三种与杀虫活性有关的蛋白区带，但是从I型菌和n型菌的基因组DNA中都扩增出同样大小的毒素基因片段。 x nemat叩hila HB310、Srio、HBml、A24和p luminesense HB202、DI、HBgy等多株共生菌对棉铃虫和小菜蛾等有较高的口服胃毒活性，其中X nem“toPhila所有品系的杀虫活性均高于其它种类的菌株。不同属、种及同种不同品系的共生菌对同种昆虫的胃毒活性差别很大，同一菌株对不同昆虫的毒力差别也较大。小菜蛾对共生菌是比较敏感的，尤nematOPhila HB3 10、Srio、HBml和p luminesense HBZoZ、DI、HBgy等6个菌株的发酵液在72h均可100%杀死小菜蛾2龄幼虫。对HB310菌株杀虫活性的深入研究表明，该菌的杀虫谱较广，对鳞翅目和鞘翅目的10种昆虫都有胃毒活性，特别是小菜蛾、菜粉蝶、云斑粉蝶和马铃薯二十八星瓢虫等幼虫有很强的胃毒活性，其发酵液对四种幼虫在72h的致死率达到100%。对棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟等幼虫的生长有很强的抑制作用。HB310菌株在对数生长初期已开始产生杀虫毒素，在对数生长中后期(15h)其杀虫活性己达到最高。 HB310菌株发酵液中的细胞和胞外上清蛋白提取物中都含有较强的血腔注射杀虫活性物质和口服胃毒素。通过native一PAGE从胞内蛋白提取物中分离出2种有胃毒活吐的蛋白组份(toxinx和toxin 11)和1种血腔注射活性的蛋白组份(toxin 111)，同时从胞外蛋白提取物中也分离到这三种毒素。SDS一PAGE电泳图谱显示两种胃毒素分别含有3一4个多肤，而血腔毒素只看到一条带，可能是一种单体蛋白。纯化的血腔毒素对5龄大蜡螟幼虫血腔注射LD50为1 81 .sng/头。血腔毒素耐70℃处理10 min;胃毒素耐50℃处理10 min，对其杀虫活性无影响。血腔毒素能够破坏血细胞成碎片。构建了X nematoPhila HB310基因组DNA粘粒文库。通过生物测定方法从Xnematophila HB310中筛选到对棉铃虫初孵幼虫有口服胃毒活性的2个克隆:pwEBZ16和pWEB338，pWEBZ16克隆的杀虫活性显著高于pWEB33s。pWEBZ16克隆对棉铃虫幼虫的口服毒力LCS。为9.5xlo’ocells/mL。根据GenBank中x nematoPhila PMF12%致病岛上5个杀虫基因序列，设计了9对引物。用pCR的方法对pWEB216和pWEB338两个克隆进行了鉴定，从pWEB216?

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
前言  10-16
第一章昆虫病原线虫共生菌的分离及鉴定  16-25
  1.1 材料与方法  16-19
  1.2 结果与分析  19-23
    1.2.1 昆虫病原线虫及其共生菌的分离  19-20
    1.2.2 16S rDNA部分片段的PCR扩增  20
    1.2.3 共尘菌16S rDNA部分序列分析  20-23
  1.3 讨论  23-24
  1.4 小结  24-25
第二章高毒力共生菌菌株的筛选及其杀虫活性的测定  25-38
  2.1 材料与方法  25-29
  2.2 结果与分析  29-36
    2.2.1 不同菌株发酵液对棉铃虫幼虫的口服杀虫活性比较  29-30
    2.2.2 共生菌发酵液对不同昆虫的口服胃毒活性的比较  30-31
    2.2.3 HB310菌株杀虫谱的测定  31-32
    2.2.4 HB310菌株发酵液对3种十字花科蔬菜害虫的胃毒毒力比较  32-34
    2.2.5 HB310菌液不同组份对菜粉蝶1龄幼虫胃毒杀虫活性的比较  34
    2.2.6 HB310菌株生长曲线及不同培养时间对其杀虫活性的影响  34-35
    2.2.7 温度对HB310菌株胃毒活性的影响  35-36
  2.3 讨论  36-37
  2.4 小结  37-38
第三章 HB310菌株杀虫毒素蛋白的分离纯化  38-56
  3.1 材料与方法  38-43
  3.2 结果与分析  43-53
    3.2.1 HB310菌株胞内和胞外总蛋白的SDS-PAGE和native-PAGE比较  43-45
    3.2.2 HB310菌株胞内蛋白粗提物和胞外蛋白粗提物的杀虫活性  45-46
    3.2.3 胞内和胞外胃毒素和血腔毒素的分离、纯化  46-48
    3.2.4 胃毒素和血腔毒素的SDS-PAGE  48-49
    3.2.5 血腔毒素LD_50的测定  49-50
    3.2.6 温度对HB310菌株胃毒活性的影响  50-51
    3.2.7 蛋白酶对蛋白毒素的影响  51-52
    3.2.8 toxin Ⅲ毒素蛋白对大蜡螟血淋巴的影响  52-53
  3.3 讨论  53-55
  3.4 小结  55-56
第四章 HB310菌株的型变及其杀虫活性研究  56-68
  4.1 材料与方法  56-60
  4.2 结果与分析  60-66
    4.2.1 HB310菌株Ⅰ型菌和Ⅱ型菌的型态特征和生理生化特性的比较  60-61
    4.2.2 生长特性比较  61-62
    4.2.3 Ⅰ型菌和Ⅱ型菌发酵液杀虫活性的比较  62-63
    4.2.4 Ⅰ型菌和Ⅱ型菌胞外及胞内蛋白提取物的杀虫活性比较  63-64
    4.2.5 Ⅰ型菌和Ⅱ型菌蛋白质组分的差异  64-65
    4.2.6 HB310菌株Ⅰ型菌和Ⅱ型菌毒力相关基因的PCR扩增  65-66
  4.3 讨论  66-67
  4.4 小结  67-68
第五章 HB310菌株粘粒文库的构建及杀虫阳性克隆的筛选  68-83
  5.1 材料与方法  68-76
  5.2 结果与分析  76-80
    5.2.1 物理剪切后DNA大小  76-77
    5.2.2 文库的容量  77
    5.2.3 杀虫阳性克隆的筛选  77-78
    5.2.4 pWEB216克隆的杀虫毒力  78
    5.2.5 阳性克隆杀虫毒素基因的初步鉴定  78-80
  5.3 讨论  80-82
  5.4 小结  82-83
结论  83-85
参考文献  85-91
在读期间发表的论文  91-92
作者简介  92-103
致谢  103

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