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甘蓝型黄籽油菜种皮色泽相关基因的差异显示和QTL定位研究

作　者: 刘列钊
导　师: 李加纳；孟金陵
学　校: 西南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 甘蓝型油菜种皮色泽 mRNA差异显示数量性状位点遗传连锁图谱
分类号: S565.4
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

甘蓝型黄籽油菜具有种皮薄，油菜籽中纤维素、色素含量低，油分含量高(一般含油量比同类型黑籽油菜提高1.5-5个百分点)，油品清澈透明，籽饼饲料质优蛋白高等诸多优点，从而大大提高了油菜的经济价值(Tringman GR，1974)。目前，对甘蓝型黄籽油菜的研究已成为油菜研究领域的热点之一。甘蓝型黄籽油菜在品质性状上具有上述诸多的优点，但由于其有不同的来源，国内外对甘蓝型油菜黄籽性状的遗传控制有不同的研究结果，认为主基因从一对到三对，另外还受微效基因的影响。在甘蓝型黄籽油菜研究中，Van Deyzne etal．(1995)利用RFLP技术找到一个与种皮色泽连锁的标记，结果表明种皮颜色的变化与查尔酮(CHS，chalcone synthase)合成酶基因有关。Somer et al．(2001)利用DH群体，采用RAPD标记的方法获得了8个与种皮色泽紧密连锁的标记，其中与黄籽主效基因紧密连锁的两个标记的遗传距离分别为1.7cM和7.8cM。本论文研究工作主要从差异显示和QTL定位角度对甘蓝型黄籽油菜种皮色泽相关基因进行了研究。论文第一部分工作是以两组不同来源的甘蓝型黄籽油菜近等基因系为材料，利用mRNA差异显示技术对90对随机引物和锚定引物组合进行了筛选，获得一个175bp的能稳定重复出现的差异cDNA片段，该片段在两对黄籽近等系中表现出在黄籽材料中存在上调表达。回收在黄籽材料中上调表达差异片段为探针，经Northern杂交验证上述两对近等系材料总RNA，表明该差异片段在黄籽材料中的确存在上调表达。分别回收黄籽和黑籽差异表达片段，并对该差异片段进行克隆、测序。根据此序列设计两个嵌套特异引物GSP1：5’-TAGATATGTACCAGAGTCG-3’和GSP2：5’-GACAAAGAAGACCATGTCG-3’，利用PCR-Walking技术延伸该差异片段，并对该延伸序列进行回收、克隆、测序，获得大小为644bpDNA片段，序列为：ATTCGGTAGGATCCCGCAGAACGAGGCCAGGATCCTGGCCGTCCAAGACGCGTATCAATTGTGAACTTTTGAGTTTTCTCTCCCTCTCATCACCTCCCCTTCCTTATATGATTGAATACGCTTCACATTGAATAGCACACAAAGTAATAAAAAAACACATGATAGAGATGATTAGGTTTACAGTATTATCATTCTTTGTTGTTTTCCTTCTCTTATTCGCTTGCAATGAGTCTTCGGCTAAGACTGCTAAGTATGATAAGTCAGATGAGTCGGACGAAAACGACGATCTCGCCGCTGTACCGTCATGTTGTGGGTTTTCATCGCCTCTTCTGATCAAGAAAGATCAATGGAAACCAATCTTCGCGAACAAGTTCGGACAGATCTCAACCGTTCAAATCGGCGATGGATGCGGCGGGATGGGCCCTTACAAAATACATTCCATAACGCTGGAACCAAACGCGCTTATGCTCCCTCTTCTTCTTCATTCCGACATGGTCTTCTTTGTCGACTCTGGTACATATCTATAATCTGCTTCAGTGTCATGTATTCAGGGTCGGATCATAGACTTTGACACCTAAATTTTTAAGAAGTAATGTATAGTTTTTTTTCTGAAAACCAAGTAATTTATATAGTTATCGTTTACC(AAAAAAAAAAAAA)序列同源性分析表明，该序列在293-514碱基序列之间和拟南芥种子发育相关的cupin西南农业大学博士学位论文蛋白(At4936700)有较高同源性，达到89%。但目前对CuPin蛋白在拟南芥中功能还不明确，因而所获得序列还需要更多的研究，特别是在黄籽油菜中功能的鉴定。论文的第二部分[作主要是用亲本GH06和P，:，的FZ代作为构图群体。其中，亲本GH06来源于(甘蓝型黑籽油菜、芥菜型黄籽油菜)x甘蓝型黄籽油菜，亲本Pl;翎为油研2号系选后代。对FZ(132个单株)群体中具有多态性的295个AFLP、SSR、RApD及SCAR标记利用MapMaker及Map Manager QTx进行遗传连锁图谱构建，获得含174个遗传标记的连锁图谱，它们分布在22个不同的连锁群上，其中包括1个RAPD标记，1个SCAR标记，37个SSR标记及135个AFLP标记。获得的遗传连锁图谱覆盖甘蓝型油菜2688.scM，标记间平均距离为15.45cM，最小遗传距离为0.8 cM，最大遗传距离为50.scM。对上述132个FZ衍生的FZ:。家系群体种皮色泽、蛋白质含量、皮壳率、皮壳含油量、含油量及千粒重进行了考察。获得结果为:种皮色泽分布在0.23一7.22之间，家系均值4.988，偏向黄籽亲本;含油量分布在28%一42.41%之间，群体均值为35.78%;皮壳率分布在11.47阶17.42%之间，均值13.65%;蛋白质含量分布在41.46阶50.19%之间，均值为45.41%;千粒重在2.9889一5.3349之间，均值3.9889;皮壳含油量分布在6.12箫16.88%之间，均值n.29%。同时对考察的各性状相关性进行了分析，结果表明种皮色泽和皮壳率之间存在很显著的负相关，而种皮色泽和皮壳含油量之间表现明显的正相关性。种皮色泽和蛋白质含量之间存在一定的正相关性，但种皮色泽和含油量之间的相关性不显著。以上述遗传连锁图谱及FZ。家系性状平均数为基础，对控制甘蓝型黄籽油菜种皮色泽及另外4个品质性状和一个产量性状QTL进行分析，获得结果如下: 控制种皮色泽QTL定位:通过复合区间作图法对种皮色泽QTL进行分析，共检测到6个QTLs位点，解释表型变异8%一61 .6%，其中有三个QTL位点贡献率都在60%左右。该6个QTLS位点分布在2、5及19三个不同发连锁群上。蛋白质含量QTL定位:同样利用复合区间作图法对蛋白质含量进行QTL扫描检测，检测到5个控制蛋白质含量QTLS位点，解释表型变异7.8%一14.4%，5个QTL位点分布在第8、16、19三

全文目录

摘要  6-11
第一章文献综述  11-30
  1.1 甘蓝型黄籽油菜研究进展  11-13
    1.1.1 甘蓝型黄籽油菜的遗传研究  11-12
    1.1.2 甘蓝型黄籽油菜生理生化研究  12-13
    1.1.3 甘蓝型黄籽油菜育种研究  13
    1.1.4 油菜种皮色泽的分子生物学研究  13
  1.2 mRNA差异显示研究进展  13-18
    1.2.1 mRNA差异显示的基本原理和步骤  14-15
    1.2.2 差异显示的优点与不足  15-16
    1.2.3 mRNA差异显示技术在植物基因表达中的应用  16
    1.2.4 其它不同差异显示方法及其比较  16-18
      1.2.4.1 代表性差异分析  16
      1.2.4.2 抑制性扣除杂交  16-17
      1.2.4.3 基因表达连续分析  17
      1.2.4.4 DNA芯片技术  17-18
  1.3 遗传标记发展  18-23
    1.3.1 限制性片段长度多态性  18
    1.3.2 随机扩增多态性DNA  18-19
    1.3.3 扩增片段长度多态性  19-20
    1.3.4 简单重复序列  20
    1.3.5 其它遗传标记发展  20-21
    1.3.6 数量性状位点(QTL)分析方法  21-23
    1.3.7 QTL在作物遗传改良中的应用  23
  1.4 分子标记在油菜遗传改良中的应用  23-30
    1.4.1 油菜分子标记连锁图谱构建及重要农艺性状基因的定位  23-27
    1.4.2 分子标记在油菜育种中的应用  27
    1.4.3 分子标记辅助油菜品种鉴定  27-28
    1.4.4 分子标记在芸薹属遗传多样性研究中的应用  28-30
第二章引言  30-31
第三章利用mRNA差异显示技术研究甘蓝型油菜黄籽基因  31-44
  3.1 本研究的目的、意义  31
  3.2 材料与方法  31-38
    3.2.1 实验材料及来源  31
    3.2.2 实验方法  31-38
      3.2.2.1 总RNA提取  31-32
      3.2.2.2 酶解去除DNA  32
      3.2.2.3 反转录合成cDNA第一链  32-33
      3.2.2.4 PCR反应筛选引物  33
      3.2.2.5 测序胶电泳、银染检测  33-34
      3.2.2.6 差异cDNA片段的回收及再扩增  34
      3.2.2.7 Northern杂交分析  34-35
      3.2.2.8 差异片段的克隆及序列分析  35-36
      3.2.2.9 利用PCR-Walking方法延伸该差异片段  36-38
  3.3 结果与分析  38-41
    3.3.1 mRNA差别显示  38
    3.3.2 Northern杂交  38-39
    3.3.3 差异cDNA序列分析  39-41
  3.4 结论和讨论  41-44
    3.4.1 结论  41-42
    3.4.2 讨论  42-44
      3.4.2.1 甘蓝型黄籽油菜种皮色泽研究  42-43
      3.4.2.2 mRNA差异显示研究技术改进  43-44
第四章甘蓝型黄籽油菜遗传连锁图谱构建及QTL定位和分析  44-72
  4.1 本研究目的和意义  44
  4.2 材料与方法  44-50
    4.2.1 实验材料  44
    4.2.2 实验方法  44-50
      4.2.2.1 田间实验  45
      4.2.2.2 性状考察  45
      4.2.2.3 群体单株基因型分析  45-50
      4.2.2.4 数据处理  50
  4.3 结果与分析  50-65
    4.3.1 亲本及F_(2:3)性状分析  50-54
    4.3.2 AFLP和SSR扩增结果与分析  54-55
    4.3.3 SCAR和RAPD扩增结果与分析  55-56
    4.3.4 甘蓝型黄籽油菜遗传连锁图谱的构建  56-60
    4.3.5 甘蓝型黄籽油菜种皮色泽及部分品质性状QTL分析  60-65
  4.4 结论和讨论  65-72
    4.4.1 结论  65
    4.4.2 讨论  65-72
      4.4.2.1 分子标记对遗传连锁图谱构建的影响  65-68
      4.4.2.2 拟南芥基因组同油菜基因组比较研究  68-69
      4.4.2.3 QTL作图的准确性  69-70
      4.4.2.4 甘蓝型黄籽油菜黄籽基因研究  70-72
参考文献:  72-87
致谢  87-88
附录  88

甘蓝型黄籽油菜种皮色泽相关基因的差异显示和QTL定位研究

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