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水稻抗白叶枯病候选基因—Xa4的克隆研究

作　者: 王世全
导　师: 李平；翟文学；朱立煌
学　校: 四川农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 水稻基因组抗白叶枯病基因核酸结合位点富亮氨酸重复细菌人工染色体
分类号: S435.111
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

分离和克隆抗病基因并对其加以利用是研究植物—病原物互作的最终目标。目前随着植物抗病研究的深入，已经克隆了许多抗病基因。由于目前所克隆的R基因有很多都具有NBS-LRR的结构，因此许多研究都集中在具有该类结构的基因上。这些基因的产物在序列和结构上都有许多共同特征，如编码的蛋白含有C末端的富亮氨酸重复单位(LRR)和N末端的核苷酸结合位点(NBS)，NBS一般都具有如下的保守氨基酸序列：GMGGIGKTTL、LIVLDDVW、SRIIVTTR、GLPLA等。因此可以利用NBS的保守序列，设计简并引物在不同的植物的基因组去发掘新的NBS-LRR类抗病基因。众所周知，水稻白叶枯病是世界水稻3大病害之一。目前已经定位了20多个抗白叶枯病基因，并且已经克隆到两个抗白叶枯病基因Xa21和Xa1。由于植物抗病性与病原菌的致病性是相互进化的，所以克隆和研究新的抗白叶枯病基因是水稻抗病研究的客观要求。另外，随着基因组测序的进展，目前关于基因组的研究已经成为分子遗传学研究不可缺少的内容。本研究利用与白叶枯病抗病基因Xa4共分离的标记RS13，从BAC文库中筛选到Xa4的候选BAC克隆，并对这些克隆进行了序列测定和分析，主要结果如下： 1、将Xa4定位于标记56M22F和26D24R之间，分别距两个标记0.4和0.7cM，物理距离约为90kb，并且同抗病相关序列RS13共分离。 2、利用RS13从IR64的BAC文库中筛选到4个克隆，其中1个克隆14E19覆盖其余3个克隆，14E19可能含Xa4候选基因。从IRBB56的BAC文库中筛选到12个克隆，利用它们构建了覆盖物理距离约420kb的跨叠克隆群，其中106P13可能含Xa4候选基因。 3、对14E19进行了鸟枪法全序列测定，成功获得了14E19的序列完成图。对这些序列分析发现，其上有4个高度同源的NBS-LRR序列，我们将其定名为Xa4A—Xa4D。另外，在这个BAC序列上还发现一些具有其它特征的序列，这些序列是基因组的组成特征，并且与基因的存在与否有相。 4、比较发现Xa4B具有较长的LRR序列，可能具完整的Xa4基因的功能。构建了Xa4B的农杆菌转化载体，已经转移到水稻台北309中。mRNA分析也表明Xa4B极有可能为Xa4基因。6、进一步对IRBB56的BAC克隆106P13进行部分序列分析，发现其上有12个与Xa4B高度同源的拷贝。7、在106P13上发现一个重复单位为90bP的重复序列，该序列广泛存在于水稻基因组中，PcR扩增和序列数据库搜索发现该序列是水稻特有的重复序列。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
1 文献综述  9-23
  1.1 水稻基因组研究进展  9-14
    1.1.1 水稻是研究单子叶植物的模式植物  9-10
    1.1.2 水稻遗传图谱及物理图谱的构建  10-11
    1.1.3 水稻基因组序列测定及分析  11-12
    1.1.4 水稻基因组的进化  12-13
    1.1.5 水稻功能基因组研究  13-14
  1.2 水稻(植物)抗病基因研究进展  14-22
    1.2.1 植物的抗病性  14-18
    1.2.2 植物抗病基因及其克隆  18-20
    1.2.3 水稻主要抗病基因研究  20-22
  1.3 开题设想  22-23
2 材料与方法  23-35
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 水稻材料  23
    2.1.2 BAC文库  23
    2.1.3 试剂和药品  23-25
  2.2 测序亚克隆文库构建及序列测定  25-29
    2.2.1 感受态细胞的的制备  25-26
    2.2.2 BAC DNA的提取  26-27
    2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的小量制备(碱法)  27
    2.2.4 构建用于测序的亚克隆文库  27-28
    2.2.5 鸟枪法BAC序列测定  28-29
    2.2.6 序列分析及同源性比较  29
  2.3 构建用于序列补空及含候选基因(NBS-LRR)克隆的亚克隆文库的构建  29-33
    2.3.1 BAC DNA提取  29
    2.3.2 BAC DNA的部分消化  29-30
    2.3.3 载体pCAMBIA1301的准备  30-31
    2.3.4 亚克隆文库构建  31
    2.3.5 准备DNA分子杂交膜  31-32
    2.3.6 DNA分子杂交筛选含NBS-LRR序列的克隆  32-33
    2.3.7 进一步分析筛选出的含NBS-LRR序列的克隆  33
  2.4 Xa4基因定位  33-34
    2.4.1 材料准备  33
    2.4.2 水稻基因组DNA的微量提取  33-34
    2.4.3 PCR及RFLP  34
    2.4.4 Xa4物理图谱构建  34
  2.5 cDNA文库构建及文库筛选  34-35
3 结果与分析  35-57
  3.1 Xa4基因的定位及其共分离标记的获得  35-36
    3.1.1 Xa4的遗传特点  35-36
    3.1.2 Xa4的分子标记定位与共分离标记的获得  36
  3.2 Xa4候选BAC的筛选与物理图谱构建  36-39
    3.2.1 Xa4候选BAC的筛选  36-37
    3.2.2 覆盖Xa4的物理图谱构建  37-39
  3.3 候选BAC克隆14E19的亚克隆文库构建与序列测定  39-43
    3.3.1 测序亚克隆文库构建  39-40
    3.3.2 Shotgun测序  40
    3.3.3 序列完成图的获得  40-42
    3.3.4 序列完成图的验证  42-43
  3.4 序列分析  43-48
    3.4.1 14E19序列概况  43
    3.4.2 对14E19的基因预测  43
    3.4.3 14E19序列中4个NBS-LRR同源序列在水稻基因组中的分布  43-46
    3.4.4 14E19上分布的重复序列  46-48
  3.5 遗传定位确定有功能的Xa4拷贝  48-50
  3.6 mRNA分析  50-52
  3.7 Xa4B表达载体的构建与遗传转化  52-53
    3.7.1 Xa4B表达载体的构建  52-53
    3.7.2 Xa4B的遗传转化  53
  3.8 Xa4候选BAC克隆106P13的序列分析  53-56
    3.8.1 106P13上含更多的NBS-LRR序列  53-54
    3.8.2 106P13中的一个重复单位为90bp的重复序列  54-56
  3.9 结论  56-57
4 讨论  57-62
  4.1 关于水稻基因组的结构  57-58
  4.2 关于基因在转基因植物中不表达  58-59
  4.3 关于植物抗病基因和NBS-LRR编码的基因之间的关系  59-61
  4.4 关于后基因组时代的研究  61-62
参考文献  62-71
附录1 FgeneSH预测的Xa4B的氨基酸序列及结构  71-72
附录2 FgeneSH预测的Xa4基因家族其它拷贝的氨基酸序列  72-76
附录3 Fgenesh预测的部分NBS-LRR基因比较  76-80
附录4 14E19全序列  80-102
已发表及拟发表论文  102-103
致谢  103

水稻抗白叶枯病候选基因—Xa4的克隆研究

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