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人肽抗生素hPAB-β的基因克隆、表达及活性研究

作　者: 饶贤才
导　师: 胡福泉
学　校: 第三军医大学
专　业: 微生物学
关键词: 肽抗生素基因克隆化学合成序列多重比较蛋白质同源模建突变体融合蛋白杆状病毒表达系统原核细胞表达蛋白纯化抗菌活性
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

传统的抗生素是由霉菌或放线菌产生的，霉菌或放线菌是人类寻找抗生素的传统领域。肽抗生素(peptide antibiotics)或称为抗微生物肽(antimicrobial peptide)则是近年来发现的由动物、植物、昆虫等生物体基因编码的具有抗生素样活性的肽类物质。它是机体免疫系统的重要组成部分，因其在作为抗感染制剂、食品防腐剂等方面具有广阔的应用前景而成为近年来国内外研究的热点之一。迄今已从动物、植物、昆虫等生物体内分离到肽抗生素300多种，新的肽抗生素还在不断被发现，有的类别还发现存在多种突变体。不同种类、不同突变体的肽抗生素活性有不同程度差异。为了获得结构简单、活性更强的肽抗生素，研究者们常常在克隆到肽抗生素分子后，通过构建其突变体库，从中筛选更理想的目的分子。这种筛选工作量大、盲目性强、成本高，目前在高活性肽抗生素分子的设计方面可借鉴的数据也不多。基于以上认识，我们进行了：①人源肽抗生素hPAB-β的基因克隆，成熟肽的化学合成及活性初步鉴定。②hPAB-β重组杆状病毒的构建及原核高效、稳定表达工程菌的建立。③hPAB-β突变体的设计及其高效表达工程菌的构建。④融合蛋白的纯化、目的蛋白分离及复性、抗菌活性测定及突变体筛选。其实验内容和实验结果主要包括以下几个方面： 1．人源肽抗生素hPAB-β的基因克隆：①对动物23种β型肽抗生素的氨基酸序列进行对比，选择部分相似性较高的序列，分析其成熟肽的结构特点，抽提β型肽抗生素的一级结构特征，并以此为基础设计简并引物。②应用SMART PCR试剂盒和简并引物从人皮肤角质形成细胞cDNA中扩增到长分别为24obp和1 3obp左右的2种片段，将它们插入pMD 18一T载体，用酶切法初步筛选阳性重组子pM.hRABL和pM一hRABS，对阳性重组子进一步作测序鉴定。③对测序获得的DNA序列进行ORF分析，发现2个大于100bp的ORF，一个192bp，另一个147bp，第二个ORF与第一个的3’一端完全重叠，可能为假基因。真正的基因可能为第一个O即。经BLASTn检索，在GenBank中发现第一个ORF与动物p一肤抗生素高度相似，与人肤抗生素hBD一1、hBD一2、hBD一3分别有4 1 .14%、76.56%、55.21%的碱基相同，在氨基酸水平分别有36.51%、79.37%、46.03%相同。结果表明克隆到的基因极可能是人p一型肤抗生素家族中的一个新成员，将之命名为hPAB一p (human peptide antibioties一p)。④新克隆的hPAB一p编码63个氨基酸，经信号肤分析表明hPAB一p编码一22个氨基酸组成的信号肤，成熟肤为41个氨基酸，分子量4333.04Da，等电点(px)8.791。 2.hPAB一p抗菌活性初步鉴定:①采用固相法合成了hPAB一p成熟肤，经即一HPLC纯化后用质谱测定合成肤的分子量为4334.%Da，与其理论分子量相符。②采用谷肤甘肤氧化/还原法对合成肤进行复性，平板法测得复性后合成肤对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等实验菌均具有杀菌活性。 3.突变体的设计及其重组杆状病毒构建:①采用同源模建法分析hPAB一p的空间结构，并以此结构为基础，设计hPAB一p突变体hPAB一p38和hPAB一p 34。②通过引物设计引入突变和PCR扩增法获得突变体的基因序列，并将之插入杆状病毒供体质粒pFAST HTa中，筛选重组质粒进一步转染携带杆状病毒的DH 1 OBac大肠埃希菌。遗憾的是本研究在用重组杆状病毒DNA转染昆虫Sf-9细胞时未获得重组病毒。 4.h队B一p及其突变体高效表达工程菌的构建:①将用PCR扩增的h队B一p、h狱B一p 35、h队B一p 34基因，分别与pinpointXa一3质粒连接，转化JM 109大肠埃希菌，获得的工程菌在表达融合蛋白时不稳定，第5代后即见不到表达条带。②将pinpoini一hPAB-p重组质粒转化入蛋白酶缺陷BLZI大肠埃希菌，新筛选到的菌株表达的融合蛋白占细菌总蛋白的20%左右，但在传至n代后也见不到融合蛋白表达，工程菌逐步丧失融合蛋白表达能力的原因不详，可能与融合蛋白中的承载蛋白分子(Carrier protein，CP)不够理想有关。③根据肤抗生素的特性要求，特异设计并筛选到了个新的承载分子，将肤抗生素hPAB一日及其突变体hPAB一p 38、h队B一p34分别插入该承载分子3’端构建成融合基因，在两个基因间含有澳化氰 (cNBr)的裂解位点，进一步将融合基因插入pQE一32表达载体，转化大肠埃希菌筛选出pQE一h队B一p/J M 1 09工程菌，经表达分析，该工程菌表达稳定，表达的融合蛋白占细菌总蛋白的40%以上，为肤抗生素hPAB一目及其突变体的制备、纯化和筛选奠定了基础。 5.重组肤抗生素的纯化及活性测定:①大量表达并分离肤抗生素h队B-日及其突变体融合蛋白包涵体，采用smol/L尿素或6mol几盐酸肌溶解包涵体并用Ni一Nl’A柱纯化融合蛋白。②用CNBr裂解融合蛋白，经透析后用葡聚糖凝胶过滤和阳离子交换层析分离和纯化目的肤抗生素。③采用谷肤甘肤氧化/还原法对重组肤抗生素进行复性，应用平板法和稀释法测定复性目的产物对8株实验室保存菌株及10个临床分离株的杀菌活性，表明重组肤抗生素hPAB一p和突变体hPAB一日38与化学合成的hPAB一p有?

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英文缩写一览表  6-9
氨基酸缩写  9-10
英文摘要  10-14
中文摘要  14-17
论文正文人肽抗生素hPAB-β的基因克降、表达及活性研究  17-158
  前言  17-20
  第一章人肽抗生素hPAB-β的基因克隆  20-51
    第一节肽抗生素氨基酸序列的比较分析及引物设计  20-24
      材料与方法  20-21
      结果  21-24
    第二节人源肽抗生素基因的RT-PCR扩增  24-32
      实验材料  24-25
      实验方法  25-29
      结果  29-32
    第三节克隆、测序及ORF分析  32-44
      实验材料  32-34
      实验方法  34-38
      结果  38-44
    第四节讨论  44-51
  第二章 hPAB-β成熟肽的化学合成及其抗菌活性初步证实  51-64
    第一节肽抗生素hPAB-β成熟肽的化学合成  51-56
      材料与方法  51-53
      结果  53-56
    第二节合成hPAB-β的复性及杀菌活性初步证实  56-60
      实验材料  56-57
      实验方法  57
      结果  57-60
    第三节讨论  60-64
  第三章 hPAB-β突变体的设计及其重组杆状病毒的构建  64-88
    第一节 hPAB-β的同源模建及其突变体的设计  64-71
      材料与方法  65
      结果  65-71
    第二节 hPAB-β及其突变体重组杆状病毒的构建  71-83
      实验材料  71-74
      实验方法  74-78
      结果  78-83
    第三节讨论  83-88
  第四章肽抗生素hPAB-β的原核表达研究  88-117
    第一节 pinpoint表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达  88-99
      实验材料  89-90
      实验方法  90-93
      结果  93-99
    第二节承载分子的设计及目的肽的高效表达  99-112
      实验材料  99-100
      实验方法  100-104
      结果  104-112
    第三节讨论  112-117
  第五章重组肽抗生素的纯化及其抗菌活性测定  117-147
    第一节目的肽的分离和纯化  117-131
      实验材料  117-121
      实验方法  121-124
      结果  124-131
    第二节重组肽抗生素的抗菌活性测定  131-139
      实验材料  131-133
      实验方法  133-134
      结果  134-139
    第三节讨论  139-147
  第六章小结  147-149
  致谢  149-150
  参考文献  150-158
文献综述一肽抗生素及其应用前景展望  158-181
  参考文献  177-181
文献综述二肽抗生素，控制感染的新希望  181-184
文献综述三人β型肽抗生素研究进展  184-189
学习期间发表文章及获得基金资助情况  189-190

人肽抗生素hPAB-β的基因克隆、表达及活性研究

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