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转基因植物外源基因的检测方法及整合位点的研究

作　者: 李少骞
导　师: 李栒
学　校: 湖南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 转基因植物 外源基因 检测方法 整合位点
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要


由于目前科学技术水平还不能精确地预测转基因可能产生的对人类及环境的安全问题，因而，开展转基因检测、鉴定，成为各国限制转基因作物大量涌入的主要措施。转基因检测的主要目的是鉴定是否为转基因、转的何种成分、含量多少以及是否为批准进口的品种等。有关转基因检测的方法，国内外已有不少报道，但具有单一性，没有通用的筛选、鉴定方法，有关整合位点的研究国外刚刚开始，国内未见报道。 本研究根据收集的国内外已商品化的转基因作物品种，选择了能基本覆盖商品化转基因品种的7个外源基因，即：CaMV35S、FMV启动子、NOS终止子、NPTⅡ标记基因和目的基因PAT、EPSPS、CryIA(b)作为筛选目标，以植物18SrRNA基因作为内源参照基因，设计了多对特异性引物，并筛选出最佳组合，优化了检测条件和参数，建立了PCR定性检测方法体系。在此基础上，根据荧光PCR原理，设计、优化引物和荧光探针，建立了荧光PCR定性检测方法体系，并以玉米内源基因(Zein)、大豆内源基因(Lectin)作为内标基因，以EPSPS和CryIA(b)作为目的基因，建立了荧光PCR定量检测方法体系。 转基因整合位点检测是鉴定转基因品种是否为批准进口转基因作物的有效的特异性方法，国外在2000年和2001年已开展了转基因玉米Bt11、Mon810两个品种整合位点的特异性检测方法研究。本研究以华番1号为试材，利用反向PCR和荧光PCR技术已成功将华番1号转基因整合位点DNA序列扩增出来。通过验证，该整合位点DNA序列具有品种特异性，从而通过外源基因整合位点的研究建立了华番1号转基因的定性、定量检测和品种特异性鉴定方法。 本研究主要研究结果摘要如下： 1、收集了国内外商品化的转基因作物17种，并通过查阅有关文献及网站，初步分析、确定了75个品种的转基因构建成分，为开展转基因检测奠定了基础。 2、不同类型的植物提取基因组DNA的方法略有差异，本研究优化了CTAB、SDS快速提取法，并选择了磁珠吸附试剂盒法，成功提取了适合于PCR反应的植物基因组DNA。 3、以植物内源基因18SrRNA为靶标，设计、优化后筛选出特异性引物和探针，建立了以 18SrRNA为目标的检测植物基因组 DNA提取质量的 PCR与荧光PCR鉴定体系。 4、首次以CaMV35S、FMV启动子、NOS终止子、标记基因NPTll、抗除草剂基因EPSPS、PAT、抗虫基因Cry1A枷）为检测目标，设计、筛选出特异性引物，优化实验参数，建立了转基因植物PCR定性检测方法体系，灵敏度达0．1％。 5、克隆了CaMV35S、FMV启动子、NOS终止子、标记基因NPTll、抗除草剂基因EPSPS、PAT、抗虫基因Cry1AO）的阳性质粒作为转基因植物检测的阳性对照。 6、于反应体系中引入UNG酶，建立了无污染的荧光PCR扩增体系。 7、首次以 FAM荧光素标记探针 5’端作为发光基团，以 TARMA标记探针3’端为淬灭基团，以 CaMV35S、FMV 启动子、NOS 终止子、标记基因NPTll、抗除草剂基因EPSPS、PAT、抗虫基因Cry1A＊）为检狈目标，设计、筛选出特异性引物和探针，优化实验参数，建立了转基因植物通用性荧光PCR定性检测方法体系。 8、以FAM和TET两种荧光素标记外源基因和内源基因，建立了转基因大豆抗除草剂基因EPSPS和转基因玉米抗虫基因Crx1A比）的荧光PCR定量检测体系，两体系的灵敏度均达到0．1％以上。 9、首次利用反向 PCR技术扩增出华番 1号基因组未知 DNA序列，并通过DNA测序，利用BLAST软件进行同源性比较，找出载体与基因组整合位点DNA序列。 10、利用荧光 PCR技术，设计出特异性引物与探针，优化实验参数，建立了一种灵敏、精确、定量和鉴定华番1号品种特异性的高效检测体系。这在国内为首次利用整合位点进行转基因植物检测和品种特异性鉴定的方法。

全文目录


中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-16
第一章 文献综述  16-46
  1 转基因农作物研究进展  16-24
    1.1 商品化转基因农作物研究状况  16-21
    1.2 商品化转基因品种及所函基因  21-24
  2 国际社会及我国对转基因植物及其产品的管理要求  24-27
    2.1 转基因的安全性问题  24-26
    2.2 各国政府对转基因植物及其产品的管理要求  26-27
  3 转基因植物及其产品检测方法研究进展  27-42
    3.1 转基因产品检测方法建立的基础  27-28
    3.2 检测方法  28-42
      3.2.1 蛋白质检测  29-32
        3.2.1.1 ELISA方法  29-31
        3.2.1.2 试纸条检测方法  31-32
        3.2.1.3 Western杂交检测方法  32
      3.2.2 DNA检测  32-42
        3.2.2.1 Southern杂交方法  33
        3.2.2.2 基因芯片检测方法  33
        3.2.2.3 PCR检测方法  33-42
          (1) PCR方法原理  35-36
          (2) 荧光PCR方法原理  36-42
  4 转基因植物品种特异性鉴定方法研究进展  42-46
    4.1 转基因植物品种特异性鉴定方法研究情况  43
    4.2 扩增未知序列DNA片段的PCR技术研究进展  43-46
      4.2.1 反向PCR(Inverse PCR)原理  44
      4.2.2 同端化PCR(UT-PCR)原理  44-46
第二章 转基因植物外源基因PCR检测方法的建立  46-63
  1 材料和方法  46-48
    1.1 材料  46-48
      1.1.1 转基因材料  46
      1.1.2 试剂及溶液  46-48
      1.1.3 仪器  48
  2 方法  48-52
    2.1 样品DNA的提取与纯化  49
    2.2 DNA纯度和浓度测定  49-50
    2.3 定性PCR检测  50-52
      2.3.1 PCR反应体系  50
      2.3.2 反应体系对照的设置  50
      2.3.3 PCR反应程序  50-51
      2.3.4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳  51
      2.3.5 PCR产物的回收  51-52
      2.3.6 PCR扩增产物DNA的测序  52
  3 结果与分析  52-60
    3.1 不同方法提取总DNA质量的比较  52-54
    3.2 植物内源18SrRNA基因的扩增与假性结果的预防  54
    3.3 35S、FMV启动子、NOS终止子的检测  54-56
    3.4 转基因植物中标记基因NPTⅡ的检测  56-57
    3.5 转基因植物中PAT、EPSPS、CrylA(b))目标基因的检测  57-59
    3.6 灵敏度试验  59
    3.7 PCR产物的回收测序(验证实验)  59-60
  4 讨论  60-63
    4.1 植物基因组DNA的提取及质量控制  60
    4.2 设立阳性对照与阴性对照、内参照的必要性  60-61
    4.3 防止污染的措施  61
    4.4 检测灵敏度的重要性  61-62
    4.5 外源基因筛选检测与鉴定检测的确定  62
    4.6 对PCR定性检测体系的评价  62-63
第三章 转基因植物外源基因荧光PCR检测方法的建立  63-88
  1 供试材料  63-65
    1.1 转基因标准物质  63
    1.2 植物样品  63
    1.3 宿主菌、供试载体及培养基  63
    1.4 供试酶类及所用试剂盒  63
    1.5 供试DNA分子量标准  63
    1.6 仪器  63-64
    1.7 试剂  64
    1.8 培养基及溶液的配制  64
    1.9 耗材  64-65
  2 方法  65-72
    2.1 荧光PCR检测的靶基因  65
    2.2 引物及荧光探针的设计  65-66
    2.3 模板DNA的提取  66-67
    2.4 所提取DNA的纯度和浓度测定  67
    2.5 荧光PCR检测的反应体系及反应条件  67
    2.6 摸板DNA提取的质量检测  67
    2.7 荧光PCR检测的可重复性  67
    2.8 荧光PCR检测的相对灵敏度检测  67
    2.9 荧光定性PCR检测  67
    2.10 荧光定量PCR检测  67-70
    2.11 PCR产物的确认  70-72
      2.11.1 PCR产物电泳分离  70
      2.11.2 PCR产物的回收  70
      2.11.3 PCR产物与载体的连接  70-71
      2.11.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  71
        (1) TSS转化法  71
        (2) CaCl_2转化法  71
      2.11.5 克隆的筛选  71-72
        (1) 裂解细菌直接PCR筛选  71
        (2) 质粒DNA的提取  71-72
      2.11.6 插入片段的序列测定  72
  3 结果与分析  72-84
    3.1 荧光PCR检测DNA提取质量结果分析  72-73
    3.2 荧光PCR检测的重复性实验结果分析  73-74
    3.3 荧光PCR检测的相对灵敏度实验结果分析  74
    3.4 荧光PCR定性检测结果分析  74-77
    3.5 转基因大豆荧光定量PCR检测结果分析  77-79
    3.6 转基因玉米荧光定量PCR检测结果分析  79-81
    3.7 PCR产物克隆的结果分析  81-82
    3.8 PCR产物序列测定结果分析  82-83
    3.9 FMV、PAT基因克隆测序及结果分析  83-84
  4 讨论  84-88
    4.1 关于荧光探针的讨论  84-85
    4.2 影响探针检测灵敏度的几个可能因素  85-86
    4.3 UNG酶及实验室的PCR产物污染问题  86-87
    4.4 荧光PCR检测的方法的评价  87-88
第四章 转基因植物外源基因整合位点的研究  88-99
  1 材料  88
    1.1 植物材料  88
    1.2 宿主菌、供试载体及培养基  88
    1.3 供试酶类及所用试剂盒  88
    1.4 供试DNA分子量标准  88
    1.5 仪器  88
    1.6 试剂  88
    1.7 培养基及溶液的配制  88
    1.8 耗材  88
  2 方法  88-91
    2.1 植物基因组与转基因连接区的选择  88-89
    2.2 引物及探针的设计与合成  89
    2.3 DNA的提取  89
    2.4 模板DNA提取浓度和纯度的检测  89
    2.5 限制性酶切  89
    2.6 内切DNA提取  89-90
    2.7 酶切效果检测  90
    2.8 T4DNA酶连接  90
    2.9 第二次限制酶内切  90
    2.10 内切DNA提取  90
    2.11 反向PCR反应  90-91
    2.12 PCR产物的确认  91
    2.13 荧光定量PCR检测与灵敏度分析  91
    2.14 华番1号特异性DNA片段的验证实验  91
  3 结果与分析  91-97
    3.1 反向PCR与荧光定量PCR反应体系的优化  91-94
    3.2 华番1号外基因整合位点DNA特异序列检测结果  94-95
    3.3 华番1号整合位点品种特异性DNA片段的验证  95-96
    3.4 荧光定量PCR灵敏度实验  96-97
  4 讨论  97-99
    4.1 荧光PCR技术检测BioSCien整合位点的特异性  97
    4.2 利用整合位点检测转基因作物可以提高荧光PCR的灵敏度  97-99
第五章 结论  99-101
  1 转基因植物外源基因PCR检测方法的建立  99
  2 转基因植物外源基因荧光PCR检测方法的建立  99-100
  3 转基因植物外源基因整合位点荧光PCR检测方法的建立  100-101
第六章 应用  101-102
参考文献  102-112
附录A1  112-113
附录A2  113-114
附录A3  114-115
附件B  115-116
致谢  116-117
作者简历  117-118
成果及论文目录  118

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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