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红细胞胞质因子对K～（562）细胞分化及其核基质—中间纤维体系影响的研究

作　者: 马文丽
导　师: 薛社普
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 中间纤维网织红细胞核基质外源基因红系细胞核纤层杂交细胞波形蛋白红细胞分化哺乳类细胞
分类号: Q813
类　型: 博士论文
年　份: 1993年
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内容摘要

本文以兔网织红细胞与人红白血病细胞融合后筛选出的胞质杂交体K—RRneo细胞为研究对象，系统地研究了细胞杂交前后的生长、分化特性及其核基质—中间纤维体系的变化规律。一、采用Lipofectin转基因的方法，首次以无核的哺乳类细胞（兔网织红细胞）作为外源基因导入的靶细胞进行实验，结果表明：网织红细胞虽然没有核，但由于它具有可供外源基因表达的完备元件，可使导入的报告基因Lac Z在胞质中表达。二、利用转入可供选择的外源基因，获得了携有pSV₂neo基因的兔网织红细胞，并使之与人红白血病细胞K₅₆₂相融合，筛选出具有G418抗性的胞质杂交体K—RRneo细胞。该实验模型较经典的诱导突变、抗性筛选、细胞融合等方法的效率明显提高，且可避免由于网织红细胞缺乏核基因组、HGPRTmRNA半衰期有限，而不能长期保持HGPRT表型的弱点，以导入基因为遗传标志，使实验模型在研究基因表达调控、肿瘤细胞恶性逆转等有关分化问题时具有实用价值。三、利用建立的胞质杂交体K—RRneo细胞为研究对象，并以其亲代的K₅₆₂细胞为对照，系统地研究了细胞杂交前后的生长及分化特性改变。结果显示：K—RRneo细胞的生长较亲代K₅₆₂细胞明显缓慢，细胞增殖率降低、分裂指数下降、DNA合成速率减慢。利用c—myc癌基因探针的分子杂交技术检测，结果可见K—RRneo细胞的c—myc基因表达明显降低，只能检测到极其微弱的c—myc mRNA。应用联苯胺蓝染色、Northern blot、RT—PCR及DNA测序等技术，分别对细胞杂交前后珠蛋白在翻译及转录水平上的表达进行了探测，结果显示：亲代K₅₆₂细胞内原已关闭的β—珠蛋白基因，在杂交细胞K—RRneo内被激活，K—RRneo细胞可检测到珠蛋白基因转录产物。上述结果以新的实验模型，又一次证实了红细胞胞质因子的存在及其对K₅₆₂细胞的恶性调控作用，为探索胞质因子对细胞分化及肿瘤细胞逆分化的调控作用提供了新的理论依据。四、采用原位选择性多步抽提、DNase I消化，制备细胞骨架整装电镜标本，并结合免疫细胞化学法、SDS—PAGE及Western印迹分

全文目录

英文缩写  4-6
全文摘要  6-8
前言  8-11
第一部分：转基因——细胞融合：实验模型的建立  11-36
  第一章：研究背景综述：真核细胞基因表达系统  12-19
  第二章：网织红细胞作为转基因靶细胞的实验性研究  19-27
  第三章：一种导入外源基因、筛选杂交胞质体的新方法—网织红细胞导入neo基因后与K_(562)细胞融合形成胞质杂交体K—RRneo细胞  27-36
第二部分：K_(562)细胞核基质—中间纤维的研究  36-60
  第四章：研究背景综述：核基质—中间纤维体系  37-44
  第五章：一种观察细胞骨架的实用有效的整装电镜制样方法  44-49
  第六章：K_(562)细胞核基质—中间纤维的整装电镜观察  49-53
  第七章：K_(562)细胞中间纤维的分布及性质  53-60
第三部分：细胞分化、排核与核基质—中间纤维关系的研究  60-92
  第八章：研究背景综述：K_(562)细胞β—珠蛋白基因表达调控  61-67
  第九章：K_(562)细胞的分化潜能—K—RRneo细胞生长与分化特性的检测  67-76
  第十章：兔网织红细胞与K_(562)细胞胞质杂交体(K—RRneo)核基质—中间纤维体系的研究  76-84
  第十一章：波形蛋白、核纤层蛋白与排核关系的研究  84-92
英文摘要  92-95
参考文献  95-107
鸣谢  107-108
第一作者文章  108-109

红细胞胞质因子对K～（562）细胞分化及其核基质—中间纤维体系影响的研究

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