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咖啡α-半乳糖苷酶基因的克隆与表达研究

作　者: 梁素钰
导　师: 郑学勤
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: α-半乳糖苷酶 cDNA克隆 咖啡豆 B→O 血型转换 P.pastoris E.coli
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


α-半乳糖苷酶(α-D-galactosidase,α-Gal,EC 3.2.1.22)是一种外切糖苷酶，广泛存在于生物界中。不同来源的α-Gal分子量介于28000～370000之间，有单体、二聚体、三聚体与四聚体形式。由于某些来源的α-Gal具有血型转换的特殊功能，对该酶的研究越来越多，从咖啡来源的α-Gal在血型转换方面的效果表现最好，目前，采用生物工程手段进行研究已开始为科枝界所关注。编码小粒种咖啡(Coffea arabica)α-Gal的cDNA约为1384bp，编码377个氨基酸，而成熟肽编码区的cDNA约为1089bp，编码363个氨基酸。 本研究分离克隆了大粒种咖啡(Coffea liberica)与中粒种咖啡(Coffea canephora)的α-Gal成熟肽编码区的cDNA，而后利用二种微生物表达系统进行重组发酵表达的研究，研究结果如下： 1．利用试剂盒的改进方法，简便、快捷而有效地提取到质量良好的热带作物咖啡的总RNA，全过程仅需2h。 2．首次从大粒种咖啡(C.liberica)与中粒种咖啡(C.canephora)中，克降到α-Gal cDNA的成熟肽编码区α-Gal-D cDNA和α-Gal-2 cDNA。克隆到的α-Gal-DcDNA编码区为1089bp，与已发表的小粒种咖啡成熟肽编码序列1080bp有98.7％同源性，共有14处碱基发生变化，氨基酸发生突变的布8个；克隆到的α-Gal-Z cDNA编码区也为1089bp，与已发表的小粒种咖啡成熟肽编码序列1089bp有99.27％同源性，共有8处碱基发生变化，氨基酸发生突变的有4个。 3．将克隆到的大粒种与中粒种咖啡的α-Gal基因，用巴斯德毕赤氏酵母Pichia pastoris表达载体pPICZαA(分泌甲醇诱导型)和pGAPZαA(分泌组成型)，成功地构建了4个酵母表达载体：pPICZαA／Gal-Z,pPICZαA／Gal-D,pGAPZαA／Gal-Z,pGAPZαA／Gal-D。 4．将克隆到的大粒种咖啡的α-Gal基因，用大肠杆菌Escherichia cali的分泌型表达载体pET-22b(+)，成功地构建了1个大肠杆菌表达载体：pET-22／Gal-D。 5．对重组P.pastoris工程菌pPICZαA／Gal-D／GS115、pPICZαA／Gal-Z／GS115、pGAPZαA／Gal-D／GS115进行了摇瓶发酵表达，对发酵产物进行了SDS-PAGE电泳，得到一条约为40KD的主条带，确认了rα-Gal-D与rα-Gal-Z均得到了表达；并对表达产物进行了酶活性检测，结果证明了rα-Gal-D与rα-Gal-Z均具有活性。 6．附消卜积的把）院发酵采用甲醇诱导到我休p卜1＊Z。。A叫，分泌发达的r。－Gal－D的酶活在481。时为 19．11（U／Inl）高于ro－Gal－Z在48llDI；J为 15．93（［J／Inl），蛋一质分泌品却是 r。－Ga1Z为 692．5（mg／卜）高下 r ala卜D为 504．5（lllg／卜）。说明咖，仰不同种来源的。－G。1共同在同一表达载体中，表达员有差异：八分泌表达中，蛋白质分泌最高，酶活不一定就高，二者不成Ill比。实验中对r。。刀。卜D酶活检测在 108 11时，其活性可高达 48．22（U／1ill），而 IO－GOIL则为 18．18（U／：11I）。 7．同一个咖l咋种来源的a－Gal基冈，在不同的表达政体中表达乌山有差异，甲醇诱导刊载体 pP！CZ O A优下组成刑载体 pGAPZ。A。 8．对产paslorj，1程苗pPICZ。A／GalD／GS］15讲行J十发阶规发附表达，对发酵产’物进行了S＊巳＊AOE丁匕泳，得到一条约为40KD的条带，确认了r a刁a卜D得到了表达；并对产物进行酶活性检测，证明了 r a－Gal－D只有酶活性。 9．对Ecoli工程菌PET、22／GalD／BL21进行了摇瓶发酵表达，对发酵产物进行了SDS－PAGE电泳，目的条带区分不明显：并对发酵产物进行了酶活性检测，只有做最酶活性，说明该表达载体与宿主菌可能不适于。一日。卜D基闭的表达。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
1 前言  10-33
  1.1 问题的提出  10
  1.2 血型转换研究现状  10-13
    1.2.1 血型转换的基本思路  11-12
    1.2.2 聚乙二醇包裹红细胞制备通用血  12
    1.2.3 血型转换的工具酶  12-13
  1.3 α-半乳糖苷酶的研究现状  13-19
    1.3.1 α-半乳糖苷酶的生理意义  14
    1.3.2 α-半乳糖苷酶的定位  14
    1.3.3 α-半乳糖苷酶的酶学特性  14-16
    1.3.4 α-半乳糖苷酶的其它功能及应用  16-17
    1.3.5 α-半乳糖苷酶在血型转换上的研究  17-19
  1.4 基因工程手段在α-半乳糖苷酶研究中的应用  19-22
    1.4.1 α-半乳糖苷酶基因的克隆与重组表达  19-20
    1.4.2 重组α-半乳糖苷酶在血型转换上的应用  20-22
  1.5 咖啡概述  22-23
  1.6 甲醇巴斯德毕赤氏酵母P.pastoris表达系统  23-30
    1.6.1 酵母基因表达系统概况  23-27
    1.6.2 甲醇巴斯德毕赤氏酵母P.pastoris表达系统  27-30
  1.7 论文设计思想及研究目标  30-33
    1.7.1 选题依据  30-31
    1.7.2 论文设计  31-32
    1.7.3 研究目标  32-33
2 材料与方法  33-52
  2.1 α-半乳糖苷酶基因克隆与测序  33-39
    2.1.1 材料  33
    2.1.2 菌种及载体  33
    2.1.3 试剂  33
    2.1.4 方法  33-39
      2.1.4.1 咖啡豆总RNA的提取  33-34
      2.1.4.2 PCR引物的设计与合成  34
      2.1.4.3 cDNA第一链的合成  34-35
      2.1.4.4 α-Gal的PCR扩增  35
      2.1.4.5 PCR目的片段的纯化与回收  35-36
      2.1.4.6 PCR回收产物的克隆  36-39
      2.1.4.7 克隆片段的DNA测序  39
  2.2 微生物工程菌的构建  39-46
    2.2.1 毕赤酵母pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D,pGAPZαA/Gnl-Z,pGAPZαA/Gal-D重组载体的构建  39-40
    2.2.2 pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D,pGAPZαA/Gal-Z,pGAPZαA/Gal-D重组载体的筛选、鉴定  40-41
    2.2.3 pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D,pGAPZαA/Gal-Z,pGAPZαA/Gal-D重组载体转化毕赤氏酵母及工程菌的鉴定  41-43
    2.2.4 大肠杆菌pET-22b/Gal-D重组载体的构建  43-44
    2.2.5 pET-22/Gal-D重组载体的筛选、鉴定  44-45
    2.2.6 pET-22/Gal-D重组载体转化大肠杆菌及工程菌的鉴定  45-46
  2.3 工程菌的发酵表达  46-49
    2.3.1 摇瓶发酵  46-47
      2.3.1.1 pPICzαA/Gal-Z和pPICZαA/Gal-D重组酵母的摇瓶发酵  46
      2.3.1.2 pGAPZαA/Gal-D重组酵母的摇瓶发酵  46-47
      2.3.1.3 pET-22b/Gal-D诱导型分泌重组大肠杆菌的摇瓶发酵  47
    2.3.2 发酵罐发酵  47-49
      2.3.2.1 pPICZαA/Gal-D重组酵母的发酵罐发酵  48-49
  2.4 SDS-PAGE与酶活检测  49-52
    2.4.1 SDS-PAGE电泳检测  49-50
      2.4.1.1 发酵上清液处理  49-50
      2.4.1.2 发酵产物的SDS-PAGE电泳检测  50
    2.4.2 酶活检测  50-52
      2.4.2.1 样品的处理  50-51
      2.4.2.2 标准对-硝基苯酚浓度的测定  51
      2.4.2.3 酶活检测  51-52
3 结果与分析  52-72
  3.1 α-半乳糖苷酶1cDNA基因克隆与测序  52-58
    3.1.1 咖啡豆总RNA的提取  52-53
    3.1.2 α-Gal cDNA中目的片段的PCR扩增  53
    3.1.3 PCR产物的克隆  53-54
    3.1.4 克隆片段的核苷酸序列分析  54-58
  3.2 微生物工程菌的构建结果  58-61
    3.2.1 毕亦酵母重组载体的构建结果  58-59
    3.2.2 pPICZαA/Gal-Z,pPICZαA/Gal-D,pGAPZαA/Gal-D重组载体转化毕赤氏酵母及工程菌的PCR鉴定结果  59-60
    3.2.3 大肠杆菌重组载体的构建结果  60-61
    3.2.4 pET-22/Gal-D/BL21工程菌的PCR鉴定结果  61
  3.3 工程菌的发酵表达与检测  61-72
    3.3.1 SDS-PAGE电泳检测  61-65
    3.3.2 酵母生长曲线图  65-66
    3.3.3 酵母工程菌发酵液蛋白质含量与酶活的检测  66-71
    3.3.4 pET-22/Gal-D/BL21工程菌的摇瓶发酵酶活测定  71-72
4 结论  72-74
5 讨论  74-79
  5.1 关于咖啡豆总RNA提取方法和取材  74
  5.2 PCR引物中引入酶切位点  74-75
  5.3 影响毕赤酵母高效表达外源蛋白因素  75-78
    5.3.1 转化及对重组转化子的筛选  75
    5.3.2 载体与遗传背景的影响  75-76
    5.3.3 外源基因自身的影响  76
    5.3.4 蛋白质分泌的影响因素  76-77
    5.3.5 发酵罐发酵条件的影响  77-78
  5.4 进一步研究的设想要点  78-79
参考文献  79-88
附件  88-94
缩写词  94-96
致谢  96

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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