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甜菜夜蛾热激蛋白Hsp70和Hsp90基因克隆和表达

作　者: 翟会芳
导　师: 江幸福
学　校: 中国农业科学院
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 甜菜夜蛾热激蛋白70 热激蛋白70同源蛋白热激蛋白90 cDNA克隆温度胁迫相对表达量 Real-time PCR
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)是一种世界性农业害虫。目前在我国已由间歇性暴发危害演变成常发性害虫,给农业生产造成了巨大的经济损失。甜菜夜蛾原属于热带和亚热带害虫,对高温有较强的耐受性,在我国南方地区如广东、福建和深圳以及台湾地区可终年危害,无越冬现象。同时,甜菜夜蛾也具有较强的耐低温能力,其蛹期过冷却点最低达-20℃左右,在我国长江流域可见其无滞育越冬现象,目前,在我国危害范围已达到20余个省、市、自治区,最北达到辽宁省沈阳市。尽管已有不少研究报道甜菜夜蛾在高温和低温等不利环境下的生活史对策,但这种耐受性的生化与分子机制仍未有报道,从而限制了对其生态适应性的机理认识。热激蛋白(heat shock protein Hsp)是一种抗逆蛋白,在细胞受到胁迫时表达量会增加,对细胞起到一种保护作用,帮助生物机体度过不利环境条件。本论文在克隆出甜菜夜蛾热激蛋白70及其同源蛋白(Hsp 70和Hsc70)以及热激蛋白90(Hsp 90)全长基因的基础上,进一步对幼虫和蛹在不同温度胁迫下的相对表达进行了测定,从而阐明甜菜夜蛾耐高温和抵抗低温的分子机制。主要结果如下:克隆了甜菜夜蛾Hsp 70和Hsp 90基因cDNA全长序列及Hsc70基因cDNA部分序列。根据GenBank中昆虫热激蛋白基因序列同源性设计简并引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了甜菜夜蛾Hsp 70(GenBank登录号:FJ862049)和Hsp90(GenBank登录号:FJ862050)基因cDNA全长序列以及Hsc70(GenBank登录号:GQ220728)基因cDNA部分序列。其中Hsp70基因cDNA序列全长2315 bp,包含一个2004 bp的开放阅读框,编码667个氨基酸。该序列具有HSP70家族的典型特征和特殊的功能结构域,与登录在NCBI上的多条HSP70核苷酸序列以及推导的氨基酸序列都具有较高的同源性。推测HSP70的分子式C3157H5071N899O1001S28,等电点为5.52;已得到的甜菜夜蛾Hsc70基因序列长1541bp,编码513个氨基酸。甜菜夜蛾Hsp90基因cDNA全长序列序列全长2453b,开放阅读框长2154 bp,编码717个氨基酸。预测的分子式C3645H5799N969O1163S26,相对分子量和等电点分别为82.6 kD和5.0。该序列具有Hsp90家族的典型特征和特殊的功能结构域,并且与多种生物的Hsp90核苷酸序列以及推导的氨基酸序列都具有较高的同源性。明确了高温胁迫下甜菜夜蛾幼虫体内Hsp70和Hsp90基因表达量的变化。利用β-actin作为内参基因,以含有甜菜夜蛾Hsp70和Hsp90基因的质粒为模板,结合实时荧光定量PCR(SBGY Real-timePCR)技术分别检测了37,39,41,43和45℃胁迫1h后甜菜夜蛾幼虫(2,3,4,5龄)体内Hsp70和Hsp90基因相对表达量。结果表明,高温能够显著诱导Hsp70的表达量的增加。其中在43℃和45℃胁迫下,表达量与对照(26℃)相比上升了近千倍并且差异显著(P < 0.05)。尤其是4龄幼虫Hsp70的表达量最高,是对照的2733.3倍。同时高温胁迫对甜菜夜蛾幼虫体内的Hsp90基因表达也具有显著的诱导作用。幼虫体内Hsp90基因表达量随着温度升高呈增加的趋势。43℃和45℃胁迫下,各龄幼虫体内Hsp90基因表达量均显著高于对照的(P < 0.05),但增加的倍数显著低于Hsp70,是对照的几倍。Hsp70和Hsp90基因较高的表达水平说明这两种蛋白在甜菜夜蛾幼虫抗高温中起到重要的保护作用。明确了低温胁迫下甜菜夜蛾幼虫体内Hsp70和Hsp90基因表达量的变化。采用上述相对定量技术分别检测了5,0,-10和-15℃胁迫下甜菜夜蛾幼虫(2,3,4龄)体内Hsp70和Hsp90基因相对表达量的变化。结果表明,尽管在5和0℃条件下冷胁迫3h诱导的Hsp70和Hsp90表达量与对照无显著差异(P>0.05)。但在-10℃下冷冻2h,Hsp70和Hsp90基因表达量较对照有了显著的提高(P<0.05)。由于甜菜夜蛾这3个龄期的幼虫在-15℃下暴露2 h均不能存活,其基因表达量未能测定。这说明热激蛋白只有在极端的条件下才充分的表达,从而对细胞产生保护作用,同时这种保护也只能在一定范围内起作用。明确了低温胁迫下甜菜夜蛾蛹体内Hsp70和Hsp90基因表达量变化。分别检测了5,0,-10,-15℃胁迫下甜菜夜蛾不同日龄蛹(2,4,6日龄)体内Hsp70和Hsp90基因表达量的变化。结果表明,尽管在5和0℃条件下冷胁迫3 h并不能显著诱导Hsp70和Hsp90基因的表达(P>0.05),但在-10℃下冷冻2 h,Hsp70和Hsp90基因表达量较对照有了显著的提高(P<0.05)。由于只有2日龄的蛹在-15℃下冷冻2 h能存活,并且其Hsp70和Hsp90基因表达量均显著的高于对照(P<0.05)。而4和6日龄的蛹在-15℃下暴露2h均导致死亡,其基因表达量未能测定。这说明,甜菜夜蛾Hsp70和Hsp90基因表达的上调对蛹顺利度过低温不利的环境起到重要的作用,且2日龄之前的蛹基因诱导表达量较高,耐低温能力较强。这与甜菜夜蛾蛹期耐低温能力的生态学实验结果一致。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章绪论  14-21
  1.1 甜菜夜蛾的发生与危害  14-15
  1.2 甜菜夜蛾的生物学习性  15
  1.3 热激蛋白的研究进展  15-18
    1.3.1 热激蛋白的生物学功能  16-18
    1.3.2 热激蛋白基因的表达和调控  18
  1.4 热激蛋白的应用  18-19
  1.5 研究甜菜夜蛾 Hsp70 和 Hsp90 基因的意义  19-21
第二章材料与方法  21-36
  2.1 虫源及饲养方法  21
  2.2 主要酶类和试剂及仪器  21
  2.3 甜菜夜蛾 Hsp70 和 Hsp90 基因全长 cDNA 的克隆  21-31
    2.3.1 总RNA 提取和第一链cDNA 的合成  22-23
    2.3.2 Hsp70、Hsp90 和Hsc70 基因片段的克隆  23-27
    2.3.3 Hsp70 和 Hsp90 基因 3′ RACE 克隆  27-28
    2.3.4 Hsp70 和Hsp90 基因5'RACE 克隆  28-31
  2.4 Hsp70 和 Hsp 90 基因表达的定量  31-36
    2.4.1 方案设计  31-32
    2.4.2 试虫处理  32
    2.4.3 总RNA 提取  32
    2.4.4 DNase Ι处理基因组DNA 污染  32-33
    2.4.5 cDNA 第一链的合成  33-34
    2.4.6 引物的合成  34
    2.4.7 定量片段的确认  34
    2.4.8 标准曲线的制作  34-35
    2.4.9 幼虫体内Hsp70 和Hsp90 基因表达量的检测  35
    2.4.10 数据处理  35-36
第三章结果与分析  36-59
  3.1 甜菜夜蛾 Hsp70 和 Hsp90 基因克隆和序列分析  36-47
    3.1.1 甜菜夜蛾Hsp70 cDNA 序列的克隆  36-38
    3.1.2 甜菜夜蛾Hsp90 cDNA 序列的克隆  38-41
    3.1.3 Hsp70 cDNA 序列分析  41-43
    3.1.4 Hsp90 cDNA 序列分析  43-45
    3.1.5 Hsc70 cDNA 序列分析  45-47
  3.2 Hsp70 和 Hsp90 基因的实时荧光定量 PCR  47-59
    3.2.1 特异性引物的筛选  47-48
    3.2.2 基因组DNA 的去除  48-49
    3.2.3 定量基因参照片段的确认  49-50
    3.2.4 标准曲线的制备  50-52
    3.2.5 高温胁迫下幼虫Hsp70 和Hsp90 基因表达量  52-54
    3.2.6 低温胁迫下幼虫Hsp70 和Hsp90 基因表达量  54-56
    3.2.7 低温胁迫下蛹Hsp70和Hsp90基因表达量  56-59
第四章讨论  59-64
  4.1 Hsp70 和 Hsp90 基因克隆及分析  59-60
  4.2 高温胁迫下甜菜夜蛾幼虫体内 Hsp70 和 Hsp90 基因表达水平  60-61
  4.3 低温胁迫下甜菜夜蛾幼虫、蛹体内 Hsp70 和 Hsp90 基因表达水平  61-64
参考文献  64-71
致谢  71-72
作者简历  72

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物虫害及其防治
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