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致肾盂肾炎大肠埃希菌粘附素基因papG的克隆表达及其免疫保护作用的初步研究

作　者: 郑铃
导　师: 陈锦英
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 致肾盂肾炎大肠埃希菌粘附素PapG 序列分析融合蛋白诱导表达免疫保护作用
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

尿道是最常见的细菌感染部位之一，85％以上的泌尿道感染由大肠埃希菌所致。这类大肠杆菌(致肾孟肾炎大肠埃希菌，UPEC)具有很强的泌尿道粘膜上皮细胞粘附能力。位于其表面的P菌毛能与人体泌尿道粘膜上皮细胞表面的特异性受体结合，使细菌粘附定植于粘膜细胞上，是UPEC一个重要的毒力因子，而介导菌毛粘附作用的关键因子是位于菌毛尖端顶部的粘附素PapG。由于：1．不同粘附素虽然有很高的保守性，但仍存在三种型别，各型有着不同的地区性分布、易感群体或部位，所导致的临床病症或表现也不尽相同；2．粘附素占菌毛全部蛋白的比例极少，很难直接从细菌获取能够激发宿主免疫反应的抗原量；在生物合成及转运过程中又极易被细菌周浆蛋白酶所降解，这些都给粘附素蛋白的抗感染免疫等研究造成了很大障碍。因此，本研究首先对天津地区分离的UPEC132株粘附素基因papG进行分型鉴定，然后通过基因克隆成功地构建GST-papa132稳定表达菌株并获得重组蛋白，在此基础上初步观察了融合蛋白诱导免疫应答及免疫保护的作用。第一部分UPEC132粘附素基因papG的克隆与序列分析依据PapG受体结合特性的不同，目前已发现三种类型PapG粘附素，其中Ⅱ型PapG的UPEC有重要的临床意义。迄今已报道Ⅱ型PapG可与F7-2、天津医科大学博士研究生学位论文F10和Fll等血清型的P叩A联合出现，但尚未见n型P叩G与其它类型P即A共同存在于同一菌毛的报道。在这一部分工作中，先以不同引物的两种PCR扩增，证明了天津地区分离株UPEC 132的paPG为n型粘附素基因。全基因序列分析表明，UPEc 132paPG全基因核普酸序列及其推导氨基酸序列与Fll血清型的UPECI八2的同源性分别达98.6%和98.5%，而与F13血清型的uPEcJ%株I型p叩G同源性分别为57.1%和45.9%，这为UPEC132的p即G为n型粘附素等位基因提供了证据。结合先前工作已证实的UPEcl32的P菌毛为F13血清型，表明该株P菌毛的PaPG为11型而P即A为F13型。另外，与uPEcIA21I型粘附素全基因序列比较，p叩G 132全基因存在11处点突变和1处连续三个核昔酸的缺失突变。这些突变分别为:(1)7处同义突变;(2)在特异性受体结合域和P即D蛋白作用区内各存在2处错义突变;(3)由于连续三个核昔酸的缺失突变，PaPG132蛋白较P即GIAZ少一个氨基酸残基。总之，本工作首次报道了:1.本地区UPEC感染株的菌毛组合为n型PaPG与F13型P即A，与迄今所发现的所有uPEc菌毛组合均不相同;2.本工作表明，uPEcl犯paPG全基因与国外同型粘附素(p即Gl八2)之间存在4处点突变、7处同义突变和一个3联密码子缺失。这种菌毛亚单位蛋白的组合方式和基因型的生物学意义虽还不十分明了，但为进一步的基因表达和免疫学研究奠定了基础。第二部分UPEC132 papG重组表达质粒的构建与分析菌毛介导细菌粘附、定植于宿主粘膜上皮表面，是细菌致病的主要毒力因子之一。尽管菌毛主要亚单位的抗原性是可变的，但与粘附作用相关的次天津医科大学博士研究生学位论文要亚单位却是高度保守的，后者为粘附素疫苗的研制提供了可能。在粘附素蛋白中，PaPG是介导菌毛与P血型红细胞表面Gai(al一)Qai受体特异性结合的关键成份，也是疫苗的最佳作用靶点。为了克服PaPG在菌毛中含量低不易诱导抗体以及合成过程中易被降解的问题，本部分工作采用融合蛋白的形式尝试uPEc132粘附素基因paPG的表达，即以pGEX.ZT为载体，使paPG结构基因与谷肤甘肤s一转移酶(GsT)基因共表达，构建GsT-PaPG稳定表达株以获得重组蛋白，为进一步PaPG粘附素的免疫学研究创造条件。本工作中，首先设计符合pGEx一ZT阅读框和酶切位点要求的引物，PcR获得papG132结构基因扩增产物并克隆入pGEX-ZT质粒载体.重组质粒转化Ecoli JM109后在IPTG诱导下表达融合蛋白，SDS一PAGE电泳表明其分子量约为62.95kD:ELISA检测表明与UPECJ%P菌毛特异性抗血清存在交叉反应，提示虽然PaPG132与PaPGJ%之间的同源性仅45.9%，但这两型粘附素之间仍具有部分共同的抗原决定簇或表位。这一特点提示针对不同抗原决定簇或表位所形成的抗体更具特异性。携带重组质粒的菌株保存半年并传代20次后，再如法以IPTG诱导仍可获得相同的融合蛋白表达产物，表明该融合蛋白在E.coli JM109中的表达具有良好的稳定性。重组蛋白表达量约为240“岁每1 0ml细菌培养物，其中可溶性产物约为90“岁每loml细菌培养物，占38%左右。总之，本阶段工作成功地以GsT融合蛋白方式建立了P菌毛P即G粘附素的稳定表达体系，并获得了纯化的GsT一P即G重组蛋白。这为进一步的抗原性分析等研究提供了物质基础，也为菌毛粘附素的表达提供了一种切实可行的方法。第三部分UPEC132粘附素蛋白免疫保护作用的初步研究本部分在成功地表达了GST二auG融合蛋白并获得纯化的GST，PanG重组蛋白的基础上，初步观察了融合蛋白激发兔疫反应及免疫保护的作用。主要结果有：1．应用该重组蛋白免疫小鼠，可诱导机体产生特异性抗体；2．经重组蛋白诱导兔疫应

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
前言  13-16
第一部分 UPEC132粘附素基因papG的克隆与序列分析  16-35
  材料与方法  17-23
  结果  23-33
    1 、 papG132基因的分型鉴定  23-25
    2 、 papG132全基因的克隆和序列分析  25-33
  讨论  33-35
第二部分 UPEC132 papG重组表达质粒的构建与分析  35-63
  材料与方法  37-45
  结果  45-60
    1 、重组表达质粒papG132／pGEX2T的构建  45-52
    2 、 PapG132粘附素重组蛋白的诱导表达  52-56
    3 、 PapG132重组蛋白的纯化与分析  56-60
  讨论  60-63
第三部分 UPEC132粘附素免疫保护作用的初步研究  63-87
  材料与方法  64-69
  结果  69-85
    1 、 UPEC132的OD_(600)值与活菌计数的关系  69-70
    2 、抗血清的粘附抑制作用  70-77
    3 、重组蛋白诱导的体内免疫保护作用  77-85
  讨论  85-87
小结  87-88
附录一 papG基因测序图  88-91
附录二英文缩略语  91-93
附录三 UPEC132 papG全基因序列限制性核酸内切酶酶切位点  93-100
参考文献  100-108
综述致病性大肠杆菌菌毛粘附素及其在疫苗开发中的意义  108-122
致谢  122

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