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日本血吸虫疫苗联合应用及体内电穿孔技术的研究

作　者: 戴洋
导　师: 朱荫昌
学　校: 江苏省血吸虫病防治研究所
专　业: 病原生物学
关键词: 日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗鸡尾酒式蛋白疫苗体内电穿孔联合免疫 23kDa膜蛋白磷酸丙糖异构酶 NP30-(CDR3)6 免疫保护作用
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

血吸虫病仍然是一种严重危害流行区人民健康的重要公共卫生问题。我国每年要投入大量的人力、物力和财力防治血吸虫病,虽取得了一定的效果,但由于血吸虫保虫宿主多,中间宿主钉螺分布广且难以消灭,再感染频繁发生,血吸虫病的流行形势仍十分严峻。上世纪70年代吡喹酮的问世,对血吸虫病具有良好的治疗效果,但并不能有效阻断血吸虫病的传播,再感染使化疗成本显得相对昂贵,且大规模反复化疗有产生抗药性虫株的潜在危险。因此需发展血吸虫病疫苗作为化疗的重要补充。由于血吸虫在终宿主体内不繁殖,只要能产生部分免疫保护作用就可有效降低成虫负荷,减轻由虫卵迟发型超敏反应引起的虫卵肉芽肿及其纤维化病变所致严重病理损害,同时减少虫卵对环境的污染,对控制血吸虫病的流行传播具有重要意义。DNA疫苗作为一种划时代的新技术,在抗血吸虫感染领域已进行了大量研究,显示了良好的应用前景。本实验室已构建了日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(TPI)和23kDa膜蛋白的DNA疫苗,同时还构建了TPI和日本血吸虫抗独特型抗体NP30 CDR3区6倍重复表位基因(CDR3)6的双价DNA疫苗,均在动物实验中取得一定的保护作用,但保护力并不理想,减虫率均未稳定达到50%以上。研究发现,将不同单价抗原分子疫苗直接混合在一起免疫动物,可取得较好的免疫保护效果。近年来,在疟疾、结核病、AIDS等疫苗的研究中发现,接种DNA疫苗后再用蛋白疫苗进行加强免疫,则体液免疫和细胞免疫的水平均有所升高,产生更好的免疫保护作用。另据报道,体内电穿孔可显著提高DNA疫苗的体内转染效率,进而提高抗原基因的表达,增强保护性免疫应答。本研究拟通过制备日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗,并通过两者联合免疫观察免疫保护效果;在此基础上再应用体内电穿孔技术来提高鸡尾酒式DNA疫苗的转染效率,以进一步提高其免疫保护效果,同时对其作用的机理进行初步探讨。研究内容主要包括:一、日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究大量制备质粒DNA : pcDNA3.1、pcDNA3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6,同时制备重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI和NP30。以质粒DNA pcDNA3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6等量混合后即为鸡尾酒式DNA疫苗;重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI和NP30等量混合后即为鸡尾酒式蛋白疫苗。70只BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D、E 5组,每组14只。A组为自然感染组;B组(空质粒对照组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl pcDNA3.1质粒DNA;C组(空质粒+鸡尾酒式蛋白疫苗组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl pcDNA3.1质粒DNA,第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐剂(FCA);D组(鸡尾酒式DNA疫苗组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl鸡尾酒式DNA疫苗;E组(鸡尾酒式DNA与蛋白疫苗联合免疫组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl鸡尾酒式DNA疫苗,第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA。DNA免疫组末次免疫后4周,蛋白加强组末次免疫后2周,所有小鼠同时经腹部皮肤感染40±1条日本血吸虫尾蚴。攻击感染后42 d剖杀,计数成虫数及肝脏虫卵数。首次免疫前2 d及感染前2 d分别经尾静脉采血,分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a,感染前2d取小鼠脾脏制备单个脾细胞悬液,检测脾细胞经刀豆蛋白(ConA)和日本血吸虫虫卵可溶性抗原(SEA)刺激后细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果显示,检获的成虫数,对照组A组与B组无显著差异(P >0.05),分别为25.82±3.25和25.30±3.80;相对于对照组(A组),C、D组和E组的减虫率分别为17.70%、32.88%和45.35%,D组和E组的减虫率均显著高于C组(P均<0.01),且E组的减虫率显著高于D组(P <0.01); C、D组和E组相对于对照组的减卵率分别为9.39%、36.20%和48.54%,D组和E组的减卵率均显著高于C组(P均<0.01),且E组的减虫率显著高于D组(P <0.05)。鸡尾酒式DNA疫苗、鸡尾酒式蛋白疫苗均能诱导小鼠产生特异性IgG抗体,C、D组和E组的A450值分别为1.956±0.005、1.374±0.810、2.162±0.162,与对照组相比,C、D、E组的IgG抗体水平均显著升高(P均<0.01),E组的IgG抗体水平显著高于C组(P <0.05)和D组(P <0.01),抗体亚类IgG2a/IgG1的比值分别为0.525、1.829和0.712。D、E两组小鼠脾细胞培养上清中IL-2、IFN-γ含量较空质粒对照组均有明显升高,IL-4则无明显差异。本实验表明,鸡尾酒式DNA疫苗和蛋白疫苗联合应用,具有显著的正协同作用,鸡尾酒式蛋白疫苗可显著增强鸡尾酒式DNA疫苗的免疫保护作用。二、体内电穿孔增强日本血吸虫核酸疫苗免疫保护作用的研究在第一部分实验研究的基础上,为进一步提高其免疫保护作用,拟通过采用体内电穿孔的免疫方法,探讨该免疫方法在提高免疫保护作用中的效能。制备鸡尾酒式DNA疫苗和鸡尾酒式蛋白疫苗同第一部分。70只BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D、E 5组,每组14只。A组为自然感染组;B组(电穿孔空质粒对照组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl pcDNA3.1质粒DNA,每次DNA注射后即辅以体内电穿孔;C组(电穿孔空质粒+鸡尾酒式蛋白疫苗组)空质粒免疫与体内电穿孔同B组,但于第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐剂(FCA);D组(电穿孔鸡尾酒式DNA疫苗组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl鸡尾酒式DNA疫苗,每次DNA疫苗免疫后即辅以体内电穿孔;E组(电穿孔鸡尾酒式DNA与蛋白疫苗联合免疫组)鸡尾酒式DNA免疫与体内电穿孔同D组,但于第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA。DNA免疫组末次免疫后4周,蛋白加强组末次免疫后2周,所有小鼠同时经腹部皮肤感染40±1条尾蚴。攻击感染后42 d剖杀小鼠,计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2 d及感染前2 d分别经尾静脉采血,分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a,并取小鼠脾脏制备单个脾细胞悬液,脾细胞经ConA和SEA刺激后,采用流式细胞仪检测上清中细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果显示,相对于对照组(A组), C、D和E组的减虫率分别为18.09%、45.00%和57.09%,D组和E组的减虫率均显著高于C组(P均<0.01),且E组的减虫率显著高于D组(P <0.05);C、D组和E组的减卵率分别为12.49%、50.88%和59.26%,D组和E组的减卵率均显著高于C组(P均<0.01),且E组的减虫率显著高于D组(P <0.05)。C、D、E 3组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2a/IgG1比值分别为0.394、3.518、0.914。D、E两组小鼠脾细胞培养上清中IL-2、IFN-γ含量较对照组均有明显升高,IL-4则无明显差异。本实验显示,体内电穿孔技术可显著提高日本血吸虫核酸疫苗的免疫保护作用。三、日本血吸虫核酸疫苗体内电穿孔法的进一步研究为进一步探索体内电穿孔技术增强血吸虫核酸疫苗免疫保护作用的稳定性、可靠性及可重复性,为此进行了重复性试验,以进一步验证该免疫方法的可行性。日本血吸虫“鸡尾酒式”DNA疫苗和蛋白疫苗的制备同前。96只5-6周龄的BALB/c雌性小鼠随机分成A、B、C、D、E、F、G、H 8组,每组12只,其中A组(空质粒对照组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl pcDNA3.1质粒DNA;B组(电穿孔空质粒+鸡尾酒式蛋白疫苗组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl pcDNA3.1质粒DNA,每次DNA疫苗免疫后即辅以体内电穿孔,于第9周每只小鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl福氏完全佐剂(FCA);C组(鸡尾酒式DNA疫苗组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl鸡尾酒式DNA疫苗;D组(鸡尾酒式DNA与蛋白疫苗联合免疫组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl鸡尾酒式DNA疫苗,于第9周每只小鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA;E组(电穿孔鸡尾酒式DNA疫苗组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl鸡尾酒式DNA疫苗,每次DNA免疫后即进行体内电穿孔;F组(电穿孔鸡尾酒式DNA与蛋白疫苗联合免疫组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl鸡尾酒式DNA疫苗,每次DNA免疫后即进行体内电穿孔,但于第9周每只小鼠经背部皮下多点注射100μl鸡尾酒式蛋白疫苗+100μl FCA;G组(TPI组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl pcDNA3.1-SjCTPI质粒DNA;H组(电穿孔TPI组)每只小鼠分别于第0、3、6周麻醉下经股四头肌注射100μl pcDNA3.1-SjCTPI质粒DNA,每次DNA免疫后即进行体内电穿孔。DNA疫苗末次免疫后4周,蛋白疫苗加强免疫后2周,所有小鼠同时经腹部皮肤感染40±1条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠,计数各小鼠成虫数和肝脏虫卵数。首次免疫前2 d及感染前2 d分别经尾静脉采血,分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a,并取小鼠脾脏制备单个脾细胞悬液,脾细胞经ConA和SEA刺激后,采用流式细胞仪检测上清中细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果与上次实验基本相符,B-H实验组的减虫率分别为14.77%、32.54%、43.95%、41.47%、59.38%、27.23%和42.37%,相对于对照组(A组)检获的成虫数均显著降低(P均<0.01),D组(鸡尾酒式DNA与蛋白疫苗联合免疫组)的减虫率显著高于C组(鸡尾酒式DNA疫苗组)和B组(电穿孔空质粒+鸡尾酒式蛋白疫苗对照组)(P值分别为<0.01和<0.05),经电穿孔处理后,E组(电穿孔鸡尾酒式DNA疫苗组)和H组(电穿孔TPI组)的减虫率分别显著高于C组和G组(TPI组)(P值分别为<0.05与<0.01),而F组(电穿孔鸡尾酒式DNA与蛋白疫苗联合免疫组)的减虫率显著高于D组和E组(P值均<0.01);B-H实验组的减卵率分别为20.62%、44.06%、57.57%、52.83%、67.49%、27.25%和42.75%,相对于对照组各实验组肝脏内虫卵数显著下降(P均<0.01),D组的减卵率显著高于B组和C组(P值分别为<0.001和<0.05),经体内电穿孔处理后,E组和H组的减卵率分别显著高于未经电穿孔处理的C组和G组(P值分别为<0.05与<0.001),F组的减卵率可达67.49%,显著高于D组和E组(P值均<0.05);B-H组的减雌虫率分别为30.69%、47.19%、62.60%、53.80%、72.28%、35.64%和49.60%,相对于对照组各实验组的雌虫数显著下降(P均<0.01),其中D组的减雌率显著高于B组和C组(P值分别为<0.01和0.05),经体内电穿孔处理后,H组较G组的减雌率显著升高(P<0.05),F组的减雌率达72.28%,显著高于D组和E组(P均<0.05)。各实验组均可检测到特异性的IgG抗体。经SEA特异性刺激后,各实验组的IL-2和IFN-γ水平较对照组明显升高,而IL-4则未检测到。本研究再次表明, DNA疫苗通过体内电穿孔再结合蛋白疫苗的联合应用可较大程度的提高免疫保护作用,减虫率、减雌率及肝脏的减卵率均达到接近60%和60%以上,表明该免疫方法具有较好的可重复性和稳定性,是一种较理想而且可行的血吸虫病免疫策略。进一步的研究将进行大动物保护性试验。

全文目录

一摘要  5-19
  1 中文摘要  5-11
  2 英文摘要  11-19
二前言  19-26
三研究内容  26-69
  1 日本血吸虫鸡尾酒式 DNA 疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究  26-45
    材料与方法  27-36
    结果  36-41
    讨论  41-45
  2 体内电穿孔技术增强日本血吸虫核酸疫苗免疫保护作用的研究  45-58
    材料和方法  45-49
    结果  49-54
    讨论  54-58
  3 日本血吸虫核酸疫苗体内电穿孔法的进一步研究  58-69
    材料和方法  58-60
    结果  60-67
    讨论  67-69
四结语  69-71
五参考文献  71-77
六致谢  77-78
七综述  78-93
八附录：硕士研究生在读期间发表的论文  93

日本血吸虫疫苗联合应用及体内电穿孔技术的研究

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