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水稻抗稻瘟病基因Pi-ta分子标记的建立及其应用

作　者: 王忠华
导　师: 夏英武；贾育林
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: 水稻稻瘟病抗性 Pi－ta 分子标记标记辅助选择
分类号: S435.111
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

稻瘟病是世界上最重要的水稻病害之一，每年都造成很大的损失。如何有效地控制这类病害受到当今植物病理学家和育种家的广泛关注。从长远意义上讲，抗病品种的选育是防治稻瘟病的主要途径。而抗病品种选育的最大挑战在于抗病基因的正确选择。鉴于目前世界各国主要产稻区稻瘟病真菌生理小种不能共享，人们很难开展不同水稻种质资源中抗病基因的等位性鉴定。随着DNA分子标记的出现与迅猛发展，标记辅助选择(Marker-Assisted Selection，简称MAS)技术已成为抗病基因正确选择的有效途径。但由于抗病基因与分子标记间的重组率在不同的群体中有较大的差异，同时构建分子标记的群体往往不是育种材料本身，在实际应用中有一定局限性。另外，由于目前已建立的分子标记不是基因本身，在育种大量群体中可能出现目的基因与分子标记不连锁的情形，导致抗病基因选择的失败。因此，最好的办法是利用抗病基因本身来建立相应的分子标记。抗病基因的克隆为建立这种标记提供了可能。 Pi-ta基因位于水稻第12染色体靠近着丝点附近的区域，编码由928个氨基酸残基组成的富含亮氨酸重复序列的细胞质膜受体蛋白。它是一个具有广谱抗性的抗稻瘟病基因。本研究根据该基因本身的序列来设计特异性引物，对抗病基因进行分子鉴定与选择，旨在建立一种新颖的DNA分子标记。主要结果如下： 1、利用籼稻抗病等位基因Pi-ta和粳稻感病等位基因pi-ta在DNA序列上的多态性，设计四对特异性引物YL100(5’-CAATGCCGAGTGTGCAAAGG-3’)／YL102(5’-TCAGGTTGAAGATGCATAGC-3’)(6259-6659)，YL153(5’-CAACAATTTAATCATACACG-3’)／YL154(5’-ATGACACCCTGCGATGCAA-3’)(2021-2460)，YL155(5’-AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’)／YL87(5’-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3’)(4409-5450)和YL183(5’-AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3’)／YL87(4409-5450)。前三对引物能特异性扩增出抗病等位基因Pi-ta，而第四对引物则能扩增出感病等位基因pi-ta。利用这四对引物对美国南部主要水稻品种Katy、Drew和Kaybonnet及美国加州品种M202与日本品种Nipponbare的基因组DNA进行PCR扩增，结果发现前三对引物在Katy、Drew和Kaybonnet中能扩增出与预期片断大小一样的特异性条带，分别为403bp、440bp和1042bp，而M202和Nipponpare则没有条带。第四对特异性引物扩增结果z恰恰相反，在 M202和 Nippollpare中能扩增出 1042hp的特异性条带，与预期片断大小一样，而 Kay、Drew u Kaybonnet则没有条带。这表明 Katy、Drew m KybQnnet含Pi－ta基因，而M202和Nippollpare则不含抗病基因Pi－ta。为了验证前三对引物扩增出的DNA片断的正确性，对PCR产物进行了纯化、克隆和测序，并将测序结果与GenBank数据库中已公布的Pi－ta基因相应序列进行比较，发现这三对引物所扩增出的片段的碱基序列与Pi．ta基因相应序列完全一致。这表明这些PCR扩增产物的确是Pi一a基因本身的序列。由此建立了以抗稻瘟病基因Pi．ta本身为序列的显性分子标记。 2、利用这套标记对ZI个已报道的是否含Pi－ta基因的水稻品种进行了PCR扩增，结果发现扩增结果与己报道的完全吻合。由此验证了该分子标记的可靠性。另外，我们还利用该套标记对阿肯色州30个水稻品系和世界各国130个水稻品种进行了PCR扩增，同时在温室选用稻瘟病真菌主理小种ZN 5二（IB－49）和ZN 7 u1），采用标准喷雾接种法对上述ZI个水稻品种与30个水稻品系进行致病性测试，结果发现Pi－ta基因与稻瘟病抗性完全一致，从而为抗性辅助选择（RCSIStallCC－atsistCd SCICCtiofi，RAS）提供理论依据。本研究还利用已建立的分子标记对6个F。杂交群体的350个株系进行了Pi－ta基因的早期分于检测，筛选出 118个 Pi．ta纯合的株系。同时对所有株系开展田间抗性调查，结果发现Pi－ta基因与田间抗性相吻合，这进一步确立了该套标记在抗性辅助选择中的应用价值。 3、以美国南部主要抗病水稻品种 Katy和 Kaybonnet为供体亲本的 4个F。群体（含 25个单株）为材料，利用已建立的 Pi－ta标记与微卫星标记，同时结合稻瘟病真菌人工接种试验初步探讨了 Pi－to基因与美国稻瘟病优势菌系 IB49和 ICd抗性之间的关系。结果发现在四个杂交F。群体中，所有抗病单株均含抗稻瘟病基因 Pi－ta，而感病锨则不含Pi－ta。F3代植株抗病性测试与抗病基因检测试验表明两者依然一致。这表明Pita基因与美国优势菌系抗性密切相关。 4、本试验根据抗病基因Pi－ta和感病等位基因pi－ta在DNA序列上的单核音酸长度多态性uingle Nucleotide Length Pol帅orphism，简称SNLP）设计两对特异性弓物YL155／YL200（5’－AGAGCCAAAThGCCAATfCA－3’）和YL183／YL200，并将这两对引物的正向序列YL155和YL183分别标上蓝色与绿色染料，对24个F。单株 6（Katyhoglol 00）和20个水稻品种进行PCR扩增，经ABI3700自动分析仪处理，再进行数据分析，同时利用已建立的尸

全文目录

本研究的创新性  14-15
缩略语  15-16
表格一览表  16-17
图一览表  17-18
摘要（中文）  18-21
摘要（英文）  21-24
第一章文献综述  24-50
  1．1 抗稻瘟病遗传与抗病基因定位  25-33
    1．1．1 经典遗传分析法  25-27
    1．1．2 分子标记定位法  27-33
      1．1．2．1 定位抗性基因的分子标记  27-28
      1．1．2．2 稻瘟病抗性基因的分子标记定位  28-33
  1．2 抗病基因等位性分析  33-34
  1．3 抗病基因分子标记辅助选择  34-35
  1．4 抗病分子作用机制研究进展  35-48
    1．4．1 抗病基因的克隆及结构分析  35-36
    1．4．2 病原菌无毒基因及相关致病因子的克隆与研究  36-38
    1．4．3 信号传导相关因子的克隆及结构分析  38
    1．4．4 植物-病原菌相互作用的研究  38-48
  1．5 本文研究目的、意义与内容  48-50
    1．5．1 研究目的与意义  48-49
    1．5．2 研究内容  49-50
第二章水稻抗稻瘟病基因Pi-ta显性分子标记的创建  50-74
  2．1 材料与方法  50-58
    2．1．1 供试材料  50-51
    2．1．2 萌发与移栽  51
    2．1．3 水稻基因组DMA提取  51-52
    2．1．4 PCR扩增  52
    2．1．5 PCR产物的纯化  52-53
    2．1．6 PCR产物的克隆  53-56
    2．1．7 质粒DNA提取  56
    2．1．8 DNA插入片断大小检测  56
    2．1．9 测序及分析  56-58
    2．1．10 抗病性测试  58
  2．2 结果与分析  58-71
    2．2．1 Pi-ta基因分子标记的创建  58-61
    2．2．2 Pi-ta分子标记辅助选择稻瘟病抗性育种  61
    2．2．3 Pi-ta分子标记在种质资源鉴定中的应用  61-62
    2．2．4 Pi-ta基因与抗病性的关系  62-71
  2．3 讨论  71-74
    2．3．1 水稻抗病育种的主要挑战与Pi-ta基因分子标记建立的意义  71-72
    2．3．2 Pi-ta基因分子标记在辅助选择及抗病机制研究中的应用  72-73
    2．3．3 影响Pi-ta PCR反应质量的主要因素  73-74
第三章抗稻瘟病基因Pi-ta与美国优势菌系抗性之间的关系  74-89
  3．1 材料与方法  74-77
    3．1．1 供试材料  74-75
    3．1．2 萌发与移栽  75
    3．1．3 稻瘟病人工接种  75-76
    3．1．4 水稻基因组DNA提取  76
    3．1．5 PCR扩增  76-77
    3．1．6 微卫星标记分析  77
    3．1．7 SSR标记与Pi-ta基因的连锁分析  77
    3．1．8 统计分析  77
  3．2 结果与分析  77-79
    3．2．1 Katy和Kaybonnet对美国优势菌系抗性的遗传分析  77-78
    3．2．2 Katy和Kaybonnet中抗稻瘟病基因Pi-ta的遗传分析  78
    3．2．3 Pi-ta基因与美国优势菌系抗性之间的关系  78
    3．2．4 Pi-ta基因与微卫星标记的连锁分析  78-79
  3．3 讨论  79-89
第四章水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的创建  89-100
  4．1 材料与方法  89-92
    4．1．1 供试材料  89
    4．1．2 萌发与移栽  89-90
    4．1．3 稻瘟病人工接种  90
    4．1．4 水稻基因组DNA提取  90
    4．1．5 共显性标记的PCR扩增  90-91
    4．1．6 共显性标记PCR扩增产物的分离  91
    4．1．7 数据分析  91-92
    4．1．8 测序  92
    4．1．9 显性标记PCR扩增  92
  4．2 结果与分析  92-93
    4．2．1 Pi-ta基因共显性标记的建立  92
    4．2．2 F_2代植株中Pi-ta的基因型分析  92-93
    4．2．3 抗病反应分析  93
    4．2．4 水稻种质资源中Pi-ta的基因型鉴定  93
  4．3 讨论  93-100
    4．3．1 共显性标记的建立  93-94
    4．3．2 共显性标记建立的意义及潜在应用价值  94-100
参考文献  100-116
附录A：攻读博士学位期间发表或录用的论文  116-119
附录B：作者简介  119

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta分子标记的建立及其应用

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