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日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定

作　者: 蔡鹏飞
导　师: 王恒
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 日本血吸虫表位改组四次跨膜蛋白-2 免疫逃避
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 99次
引　用: 1次
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内容摘要

血吸虫病是世界上严重危害人类健康的寄生虫病之一,流行于世界上76个国家和地区,目前有2亿感染者。流行于我国的日本血吸虫病是所有血吸虫病中防治难度最大的一种。利用吡喹酮治疗在控制该病的过程中起到重要作用,但治疗后的反复感染,及反复化疗可能产生抗药性问题,使得仅靠单一药物治疗无法从根本上控制血吸虫病的传播。研发安全有效的抗血吸虫疫苗,单独使用或结合化疗将极大地推动血吸虫病的防治工作。但早期研制的疫苗,从安全性或保护效果来看并不令人满意。因此,新型抗原的鉴定和新型疫苗的研制是一项十分紧迫的任务。本研究通过生物信息学方法,从日本血吸虫的8个关键抗原中筛查18个表位,其中5个在日本血吸虫中鉴定,其余13个为曼氏血吸虫中鉴定的表位在日本血吸虫中的同源序列。利用表位改组技术成功构建5个不同长度的随机串联多表位人工抗原文库,并证明文库具有良好的表位串联多态性。不同文库免疫小鼠后抗体水平的检测,表明多表位基因的长度对文库的抗原性具有显著的影响。保护性实验结果显示5个文库的保护效果并不理想,可能与所选的多数表位并未在日本血吸虫中得到有效证实有关。文库L2取得部分的抗生殖作用,表明只有合适长度的多表位基因文库才有可能诱导较好的免疫保护作用。通过上述工作,证实新型表位改组技术能应用于不同病原体多表位文库的构建,确定可能诱导保护性免疫反应的多表位基因长度;同时提示要构建具有高保护性的日本血吸虫多表位人工抗原文库,仍有待于保护性表位的鉴定。曼氏血吸虫表膜四次跨膜蛋白家族成员被认为是具有保护潜力的抗原分子,其中是曼氏血吸虫新型抗原TSP-2更是获得高达～60%的保护力,本研究对Sm-TSP-2在日本血吸虫中的同源分子展开鉴定和评估。研究证实日本血吸虫Sj-TSP-2分子存在广泛变异,根据C、D变异区不同,可分为七个亚类,同时存在不同亚类之间重组的杂合分子;三级结果预测显示主要变异区暴露于分子的表面,表明此分子受正选择作用,并提示其配体的多样性;单一成虫RT-PCR显示Sj-tsp-2亚类表达谱在个体成虫中存在极大的差异,以上研究结果提示Sj-stp-2可能参与日本血吸虫的免疫逃避。半定量RT-PCR表明Sj-tsp-2基因在日本血吸虫尾蚴、童虫、雌雄成虫和虫卵中都有不同水平的转录;但Western blot分析显示Sj-TSP-2蛋白并不在虫卵期表达。免疫荧光定位实验表明Sj-TSP-2定位于肺期童虫的表膜,但在天然状态下并不暴露;而活体成虫及冰冻切片免疫荧光实验则证实Sj-TSP-2分子暴露于雌雄成虫的体表。免疫保护实验显示单一Sj-TSP-2亚类重组蛋白不能获得任何的保护效果,所有亚类重组蛋白的混合物也只获得较低的保护力,再次提示Sj-TSP-2分子与免疫逃避相关,变异如此广泛的Sj-TSP-2并不适合成为日本血吸虫的候选抗原。以上工作显示表膜蛋白TSP-2在曼氏血吸虫和日本血吸虫中极大的差异性,说明曼氏血吸虫的保护性抗原,其在日本血吸虫中的同源分子并不一定同样具有保护性;提示在不同环境压力下,日本血吸虫可能采取了不同于曼氏血吸虫的免疫逃避策略,在一定程度上佐证了前一部分的结果,进一步强调日本血吸虫特异的保护性抗原和表位的鉴定对于日本血吸虫疫苗的研制的重要性。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-16
实验材料  16-28
  一、基本材料  16-24
    1 主要化学试剂及部分耗材  16
    2 生物学试剂  16-19
    3 引物  19-21
    4 合成肽  21
    5 质粒载体  21-24
    6 菌株  24
    7 阳性钉螺  24
    8 实验动物  24
    9 血清  24
  二、主要仪器设备  24-25
  三、分析软件  25-26
  四、主要溶液配制  26-28
实验方法  28-69
  1 常用的分子生物学方法  28-38
  2 表位基因DNA人工合成及克隆  38-40
  3 多表位基因的随机重组表达文库的构建  40
  4 多肽合成  40-41
  5 RT-PCR  41-44
  6 日本血吸虫尾蚴、肺期童虫、成虫及虫卵的分离收集  44-46
  7 日本血吸虫尾蚴、肺期童虫、成虫及虫卵膜蛋白抽提与分离  46-48
  8 SWAP(Soluble worm antigen preparation)制备  48
  9 重组蛋白表达以及纯化前的细菌处理  48-51
  10 蛋白质去内毒素  51-52
  11 蛋白质浓度的检测  52-53
  12 多克隆抗血清的制备和纯化  53-54
  13 普通SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  54-56
  14 Western Blot  56-59
  15 酶联免疫吸附测定  59-61
  16 间接免疫荧光分析  61-63
  17 细胞生物学方法  63-66
  18 酶联免疫斑点(ELISPOT)  66-68
  19 免疫及保护性评估  68-69
实验结果  69-134
  第一部分:日本血吸虫随机重组多表位抗原文库构建及保护性评估  69-92
    1 单表位基因的选择、设计及克隆  70-72
    2 表达B表位-乙肝核心抗原重组蛋白进行表位抗原性分析  72-74
    3 利用人工合成多肽分析B表位抗原性  74-78
    4 多表位基因的随机组装  78-81
    5 多表位基因真核表达文库的构建  81-82
    6 多表位基因文库的免疫原性  82-84
    7 多表位基因文库的保护性  84-85
    讨论  85-91
    小结  91-92
  第二部分:日本血吸虫新型表膜蛋白TSP-2鉴定、表征及评估  92-134
    1 日本血吸虫Sj-tsp-2分子的克隆和序列分析  93-110
    2 单个成虫Sj-tsp-2亚类转录谱分析  110-111
    3 Sj-tsp-2分期转录  111-112
    4 Trx-TSP-2亚类重组蛋白的表达和纯化  112-113
    5 多克隆抗体制备  113-114
    6 各期表膜蛋白制备及Western Blot  114
    7 Sj-TSP-2在肺期童虫和成虫中的定位  114-117
    8 免疫学评价  117-122
    9 保护性评价  122-124
    讨论  124-133
    小结  133-134
参考文献  134-144
文献综述一:血吸虫候选抗原表位鉴定  144-156
文献综述二:四次跨膜蛋白分子相互作用及其功能研究进展  156-171
附录Ⅰ:本论文所用的英文缩略语  171-173
附录Ⅱ:硕博连读期间发表的文章和参加的会议  173-174
致谢  174

日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定

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