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基于IgY的Western blot法在检测日本血吸虫感染兔尿液中循环抗原的初步研究

作　者: 孙成松
导　师: 李雍龙
学　校: 华中科技大学
专　业: 病原生物学
关键词: 卵黄免疫球蛋白日本血吸虫免疫诊断尿液循环抗原
分类号: R532.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

血吸虫病是一种严重危害几类健康的几兽共患寄生虫病，我国长江流域及其以南的12个省、市、自治区的380个县，仍有不少几群受到血吸虫病的危害。早期和正确的诊断是血吸虫病防治工作的重点，目前多采用免疫学方法对疾病进行诊断和对疫情进行监测。血吸虫病免疫学诊断包括循环抗体（CAb）和循环抗原（CAg）的检测，循环抗体检测技术已较成熟，敏感性和特异性均较高，但难以区分既住感染和现症感染，无法考核疗效，不利于血吸虫病的监测，而检测循环抗原能够评估活动性感染和感染度，具有较好的疗效考核价值，同时还可作为现症感染的依据，但循环抗原的含量相对较低，其检测存在敏感性和特异性低等问题，且由于循环免疫复合物（cIc）的存在，使其检出率进一步降低。传统的免疫学诊断方法大多是通过检测血清，受检者不易接受，特别是在进行大规模流行病学调查时，群体依从性较差，此外也可能导致医源性感染。而通过检测尿液或唾液诊断血吸虫病是一种既简便实用又无损伤性的免疫学方法，具有较大的发展前景。鸡卵黄免疫球蛋白（Egg y01k immunoglobulin，IgY）是一种新型多克隆抗体，能够提高免疫学诊断的敏感性和特异性，而且产量高、性质稳定，近年来，IgY被广泛应用于疾病的免疫学诊断。本研究首先利用甘氦酸盐酸缓冲液（简称甘盐液）解离日本血吸虫感染兔尿液中的循环免疫复合物，并通过抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原（Soluble egg antlgen，sEA）的鸡卵黄免疫球蛋白IgY，采用western blot技术对解离后的循环抗原进行检测。为使所使用的IgY抗体具有均一的效价，首先将免疫后第30-60天的Igy抗体充分混合并分装，BcA法检测其蛋白浓度为82ug/u1，并采用间接EI』IsA法重新鉴定其效价。为测定IgY抗体效价所制备的sEA的蛋白浓度为3 1ug/u1，间接EI』IsA法测定sEA效价高达1：12800以上。采用BcA法测得日本血吸虫感染兔和正常兔尿液的蛋白浓度分别为9 9ug/u1和2.8 ug/ul，并对其进行十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（sDs．PAGE）。结果发现，正常兔尿液样本中未见明显蛋白条带；感染兔尿液标本在未作免疫复合物解离和裂解变性前，有2条主带和3条次带，主带分子量为146kDa和60kDa，次带分子量分别为108k₁)a、72kDa、67kDa；而利用甘盐液解离感染兔尿液标本中的免疫复合物并作裂解变性后，仅见1条主带和1条次带，分子量分别为68t(Da和86k。Da。对甘盐液处理并裂解变性后的感染兔尿液标本作免疫印迹（western blot）分忻，结果显示其与日本血吸虫感染兔血清和免疫后30．60天混合IgY抗体反应的蛋白条带均为68kDa，而与正常兔血清和未免疫的IgY反应不产生条带。本研究首先通过间接EI』IsA法对免疫后30．60天混合IgY抗体的效价进行鉴定，然后利用sDs．PAGE对日本血吸虫感染兔和正常兔尿液中的蛋白组分进行了分忻，最后采用westerll blot法对感染兔尿液中解离后的循环抗原进行检测，结果初步证实了IgY在检测感染兔尿液中的循环抗原具有一定的价值，有望进一步丰富和完善血吸虫病的免疫学诊断。

全文目录

主要缩略词  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-14
材料与方法  14-24
结果  24-30
讨论  30-33
参考文献  33-37
综述  37-58
  参考文献  52-58
致谢  58

基于IgY的Western blot法在检测日本血吸虫感染兔尿液中循环抗原的初步研究

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