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水稻组蛋白去乙酰化酶基因的分离和功能鉴定

作　者: 黄利民
导　师: 周道绣
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻组蛋白修饰组蛋白去乙酰化酶转座因子细胞程序性死亡超敏反应 DNA片段化芯片
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

表观遗传学是指在DNA序列不改变的情况下,碱基序列以外的各种修饰和与之相关的各种蛋白质或RNA协同作用下,调控基因的表达,以完成生命周期或适应环境变化,且可以在世代之间传递。表观遗传学涉及的机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质变构等方面。组蛋白乙酰化是真核生物表观遗传调控的重要组成部分。水稻是世界上重要的粮食作物,有关水稻表观遗传学的研究报道目前很少。本研究主要以水稻中的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）基因为对象,通过生物信息学、基因克隆和转化等方法研究了水稻HDAC基因的结构、表达及其生理功能,阐述了HDAC基因在植物的表观遗传调控及其环境适应中的重要意义。本研究主要有以下结果:1.通过同源序列法研究发现,水稻基因组数据库中存在着19个组蛋白去乙酰化酶的基因,其中RPD3/HDA1超家族的组蛋白去乙酰化酶基因14个,HD2家族3个,SIR2家族2个。2.对水稻HDAC的三个不同家族基因成员分别进行了序列分析比较和系统进化分析。3.共构建了10个基因的RNAi抑制表达载体,5个基因的超量表达载体,并获得转基因植株。4.以SIR2家族的OsSRT1基因为重点展开研究。通过Northern杂交对其表达模式研究发现,OsSRT1在快速分化的器官和组织中高水平表达。OsSRT1蛋白定位于细胞核内。5.Western杂交证据显示,OsSRT1抑制表达家系的组蛋白H3K9（lysine-9 of H3）的乙酰化程度增加,而H3K9的双甲基化程度降低。OsSRT1 RNAi转基因植株中发生H₂O₂的产生,DNA片段化和细胞死亡,产生假病斑表型变异,属于超敏反应类型的程序性细胞死亡。6.OsSRT1的超量表达不产生明显的形态变异,但能增强植株对于百草枯的耐受能力,提高超量表达转基因家系对氧化胁迫的抗性。7.为了进一步分析OsSRT1所调控的下游基因以及其调控方式,本研究采用Affymetrix水稻全基因组生物芯片对抑制表达植株中基因表达状况进行了分析。结果表明,抑制表达植株中转座子和反转座子以及超敏反应相关的基因和细胞程序性死亡有关的基因的转录被激活。8.对抑制表达植株芯片分析中所获得的差异表达基因进行了深入的分析。差异表达基因的Gene Ontology（GO）分类显示OsSRT1正调控防御反应、DNA修复和苯丙醇代谢过程,这些基因大都涉及胁迫相关细胞程序性死亡信号途径相关的基因。9.通过RT-PCR验证了RNAi植株中一些衰老相关基因、病程相关蛋白基因等标志基因的表达,进一步证实了其与PCD的关系。10.通过染色质免疫沉淀技术和Real-time PCR检测发现,这些上升表达的转座子和反转座子以及细胞程序性死亡相关基因的启动子区域组蛋白H3K9乙酰化程度明显上升,因此推测这些基因是OsSRT1的直接靶基因。11.DNA甲基化分析结果暗示,OsSRT1的下降表达很可能是以一种随机的方式作用于DNA甲基化。12.分别对HD2家族的OsHDT702基因和RPD3/HDA1超家族的OsHDA710基因的RNAi转基因家系进行了初步观察,发现它们可能分别与植株叶片形态和植株高度有关。通过对上述问题的研究,揭示了水稻组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1在保护基因组稳定和防止DNA损伤,维持植物细胞的正常生长方面具有重要的作用。加深了表观遗传调控网络对生物发育、疾病、植物抗逆等许多重要生命现象调控的理解和认识。

全文目录

缩略词表  7-8
中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1.文献综述  12-33
  1.1 组蛋白乙酰化的表观遗传基础  12-16
    1.1.1 染色质的基本结构单位——核小体  12-13
    1.1.2 异染色质与染色质沉默  13-14
    1.1.3 染色质重建是基因表达调控过程中的重要环节  14
    1.1.4 染色质调节因子  14-15
    1.1.5 组蛋白修饰及其在基因调节中的作用和机制  15-16
    1.1.6 组蛋白乙酰化模式在发育过程中的传递  16
  1.2 组蛋白乙酰化在基因转录调控中的作用  16-22
    1.2.1 组蛋白乙酰化位点  16-17
    1.2.2 组蛋白乙酰化对染色质结构的作用机制  17
    1.2.3 组蛋白乙酰化酶(Histone Acetyltransferase/HAT)  17-19
      1.2.3.1 组蛋白乙酰化酶的分类  17-18
      1.2.3.2 组蛋白乙酰转移酶(HAT)的作用方式  18-19
    1.2.4 组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase/HDAC)  19-21
      1.2.4.1 组蛋白去乙酰化酶的分类  19-21
      1.2.4.2 组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的作用方式  21
    1.2.5 组蛋白去乙酰化酶基因在植物基因调控和发育中的作用  21-22
  1.3 与本研究有关的DNA甲基化研究进展  22-25
    1.3.1 植物DNA甲基化特征  22-23
    1.3.2 植物DNA甲基转移酶  23-24
    1.3.3 植物DNA甲基化的生物学功能  24
    1.3.4 DNA甲基化与植物转座因子活动  24-25
      1.3.4.1 转座因子及其结构特点  24-25
      1.3.4.2 DNA甲基化对转座因子的调节  25
  1.4 与本研究有关的细胞程序性死亡的研究现状  25-27
    1.4.1 细胞程序性死亡的概述  25
    1.4.2 植物PCD的特征  25-26
    1.4.3 植物PCD的相关基因及其调控信号  26
    1.4.4 植物超敏反应与PCD  26-27
  1.5 植物染色质因子及细胞程序性死亡的研究方法  27-31
    1.5.1 功能获得与缺失  27-28
    1.5.2 染色质免疫沉淀  28-29
    1.5.3 DNA甲基化  29-30
    1.5.4 基因芯片  30-31
    1.5.5 TUNEL assay  31
  1.6 本研究的目的和意义  31-33
2 材料与方法  33-48
  2.1 水稻材料  33
  2.2 水稻组蛋白去乙酰化酶基因的整理和归类  33
  2.3 序列分析  33-34
  2.4 水稻组蛋白去乙酰化酶(HDAC)基因的获取  34
  2.5 载体的构建  34-35
    2.5.1 转化载体  34
    2.5.2 亚细胞定位载体  34-35
  2.6 遗传转化  35-36
  2.7 总DNA抽提与SOUTHERN杂交  36-37
  2.8 RNA抽提、RT-PCR和NORTHERN杂交  37-38
  2.9 水稻全基因组芯片分析  38-39
  2.10 活性氧(ROS)积累的检测  39
  2.11 原位TUNEL分析  39-40
  2.12 GFP观察  40-41
  2.13 组蛋白抽提和WESTERN印迹  41
  2.14 染色质免疫沉淀和定量PCR分析  41-42
  2.15 氧化胁迫处理  42-43
  2.16 DNA胞嘧啶甲基化分析  43-48
3 结果与分析  48-97
  3.1 水稻基因组中组蛋白去乙酰化酶基因的分离克隆与转基因材料的获得  48-67
    3.1.1 组蛋白去乙酰化酶基因全长编码序列的获得与序列分析  48-64
      3.1.1.1 RPD3/HDA1超家族HDAC基因克隆与序列分析  48-54
      3.1.1.2 HD2家族组蛋白去乙酰化酶基因克隆与序列分析  54-60
      3.1.1.3 SIR2家族组蛋白去乙酰化酶基因克隆与序列分析  60-64
    3.1.2 遗传转化材料的获得  64-67
      3.1.2.1 抑制表达载体的构建  64
      3.1.2.2 超量表达转化载体的构建  64-65
      3.1.2.3 农杆菌介导的转化  65
      3.1.2.4 转基因植株的阳性检测和拷贝数分析  65-67
  3.2 转基因材料分析与HDAC功能研究  67-97
    3.2.1 组蛋白去乙酰化酶基因OsSRT1对程序性细胞死亡的调控作用  67-91
      3.2.1.1 OsSRT1基因结构分析  67-69
      3.2.1.2 OsSRT1表达模式  69-70
      3.2.1.3 OsSRT1的亚细胞定位  70-71
      3.2.1.4 OsSRT1的抑制表达家系出现假病斑表型  71-75
      3.2.1.5 OsSRT1抑制表达诱导水稻植株的氧爆发  75-76
      3.2.1.6 OsSRT1转基因假病斑植株中TUNEL测定  76-77
      3.2.1.7 OsSRT1超量表达增加了植株的氧化胁迫耐受能力  77-79
      3.2.1.8 OsSRT1的抑制表达表达植株水稻全基因组芯片分析  79-85
      3.2.1.9 OsSRT1 RNAi诱导转座因子和PCD标志基因的H3K9乙酰化  85-88
      3.2.1.10 胞嘧啶甲基化分析  88-90
      3.2.1.11 转座分析  90-91
    3.2.2 OsHDT702表达受到抑制后对水稻叶片形态的影响  91-93
    3.2.3 OsHDA710表达受到抑制后对水稻植株高度的影响  93-97
4 讨论  97-100
  4.1 OsSRT1可能具有更加广泛的功能  97-98
  4.2 OsSRT1在细胞程序性死亡途径的调控作用  98
  4.3 OsSRT1在保持基因组的稳定性上的重要性  98-100
参考文献  100-112
附录Ⅰ 部分实验的操作流程  112-119
附录Ⅱ 简历  119-120
致谢  120

水稻组蛋白去乙酰化酶基因的分离和功能鉴定

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