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钛颗粒对异位骨化局部干预的基础研究

作　者: 袁平
导　师: 王万春
学　校: 中南大学
专　业: 外科学
关键词: 异位骨化动物模型跟腱切断术钛颗粒免疫组化 RAW264.7 炎症因子活化T细胞核因子（NFATC1） MC3T3-E1 增殖分化矿化 Runx2/Cbfα1 OPG RANKL
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的通过建立钛颗粒局部干预抑制异位骨化形成的动物模型,初步探讨钛颗粒抑制异位骨形成的可能性和发生机制,为异位骨化的防治提供一个新的方法开拓新的思路。方法制备动物模型：36只昆明小鼠于双侧跟腱中点行跟腱切断术,跟腱切断部位左侧注射钛颗粒的悬浊液为实验组,右侧注射生理盐水为对照组。分别在跟腱切断后于第4、8、12周随机处死12只小鼠。对处死小鼠拍摄X片,并将切取的跟腱组织分成两份,分别进行HE染色和免疫组化分析。结果1.X片显示跟腱切断术后第8周对照组跟腱切断部位58.3%(7／12)出现异位骨化；12周后,对照组跟腱部位均出现异位骨化,实验组跟腱部位有1例出现异位骨化。2.HE组织学表明,该方法形成的异位骨化为软骨内成骨。3.跟腱部组织免疫组化结果显示：①BMP-2、TGF-β在各个时间点的表达实验组均少于对照组,但两组间无显著性差异(P>0.05)；②IL-1、TNF-a的表达随时间的延长逐步减少,各个时期实验组的表达明显高于对照组,两组间有显著性的差异(P<0.05)；③Runx2/Cbfal在各个时间点的表达实验组较对照组减少,并且在术后第4周、第8周时两组间有显著性差异(P<0.05)；④MMP-9在各个时间点的表达实验组明显高于对照组,并且在术后第8周、第12周两组间有显著性差异(P<0.05)。结论1.跟腱切断的方法可以有效诱导异位骨化,结果稳定可靠；2.钛颗粒局部干预可以防止以软骨内成骨方式发生的异位骨化的形成,其机制可能为钛颗粒在部分抑制成骨的同时,增强了周围组织的破骨细胞活性产生溶骨效应。目的1.探讨钛微粒诱导巨噬细胞RAW264.7释放破骨性细胞因子的作用。2.观察钛颗粒对破骨细胞分化的影响,探讨钛颗粒防治异位骨化形成的可能机制。方法1.巨噬细胞细胞RAW264.7分别与不同浓度的钛微粒联合培养,分别在24 h、48h、72h时点取细胞培养上清液,用酶联免疫吸附法(ELISA)技术检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介-1(IL-1)白细胞介素-6(IL-6)和前列腺素E2 (PGE2)的含量。2.RT-PCR法和Western blot法分析钛颗粒干预后细胞内转录因子NFATc1在mRNA和蛋白水平的表达。结果1.钛颗粒组较对照组TNF-α、IL-1、IL-6和PGE2分泌量明显增高(P<0.05),且随浓度增高其分泌量增加;2.钛颗粒刺激后NFATc1在mRNA和蛋白水平的表达显著增加(P<0.05)。结论钛颗粒具有诱导前破骨细胞RAW264.7分泌破骨性细胞因子的作用,并刺激其向破骨细胞分化。目的通过建立小鼠前成骨细胞MC3T3-E1和钛颗粒体外共同培养的细胞模型,研究钛颗粒对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化及Runx2/Cbfα1、OPG、RANKL表达的影响,探讨钛颗粒通过作用于前成骨细胞进而影响骨代谢的可能机制。方法：1.MC3T3-E1细胞在含β2甘油磷酸钠、抗坏血酸的培养基中培养22 d。用钛颗粒干预小鼠前成骨细胞MC3T3-E1(颗粒数与细胞数之比为1 00：1),在细胞培养的不同时间(2,4,7,14 d),用四甲基偶氮唑盐检测各组细胞增殖活性;用p-NPP法测定碱性磷酸酶(ALP)活性;Van GieSon苦味酸酸性复红染色法染色细胞Ⅰ型胶原;茜素红染色观察矿化结节形成;2.用RT-PCR和Western blot的方法检测不同时间细胞中Runx2/Cbfα1在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。3.用RT-PCR和Western blot的方法检测细胞在不同钛颗粒浓度下OPG、RANKL在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果1.钛颗粒组与对照组相比各时间点细胞增殖均受抑制,且有显著性差异(P<0.05)；14 dⅠ型胶原染色可见钛颗粒组较对照组弱,碱性磷酸酶活性定量分析钛颗粒组显著低于对照组(P<0.01)；14,21 d茜素红染色可见钛颗粒组钙结节数量较对照组显著性降低(P<0.05)；2.在不同时间点钛颗粒组MC3T3-E1细胞中Runx2/Cbfα1的mRNA和蛋白表达较单纯诱导组显著下调(P<0.05)；3.钛颗粒能上调MC3T3-E1细胞OPG及RANKL的表达,且对后者作用强于前者。RANKL/OPG比率随着钛颗粒浓度的增高而增大。结论1.钛颗粒对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化功能均具有抑制作用；2.钛颗粒对MC3T3-E1细胞的分化抑制作用可能与其对Runx2/Cbfα1的表达调控有关；3.钛颗粒对破骨细胞的影响可能与其对成骨细胞RANKL/OPG途径的调控有关。

钛颗粒对异位骨化局部干预的基础研究

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