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降香对丹参的吸收动力学影响及其机制研究
作 者: 梅超
导 师: 孙晓波
学 校: 长春中医药大学
专 业: 中药学
关键词: 中药复方 君-使药对 配伍 促吸收 P-糖蛋白 摄取 Caco-2细胞 MDCK细胞
分类号: R285
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
中药复方配伍是中医药领域研究的难点问题,是中医辨证论治精髓的具体表现形式。中药复方由两味或两味以上的单味药组成,在中医理论指导下,选择合适的药物酌定药量,按照“辩证施治”的原则组方,它集中体现了中医理论治法治则、配伍理论和组方原则,是中医防治疾病的主要形式[1,2]。而药对是中药复方中最简单、最基本的药物组方形式,符合复方中“辩证施治”、“七情和合”,体现了复方的有效性和合理性,可通过研究药对配伍来揭示复方配伍的科学性和合理性,君-使药对是中药复方中的特殊对药,能体现中医药的配伍关系且组分比较简单,易于研究。因此,研究君使药对之间的相互作用及其机制,对揭示中药复方配伍规律,继承和发展中医药有重要意义。本文从简单的药对研究出发,选择了冠心丹参滴丸方中作为佐使药的降香,其含有的挥发油和黄酮-柚皮素对君药丹参中的隐丹参酮和丹酚酸B的吸收动力学影响及其促吸收机制展开研究,主要内容如下:第一部分:隐丹参酮在生物样品中测定方法的建立为本课题体内、外相关的研究,建立了简便、灵敏、可靠、无干扰的检测隐丹参酮(Cryptotanshinone,CTS)在Caco-2细胞(the hunman colon carcinoma cellline,人结肠癌细胞)中的UPLC方法、在大鼠血浆中LC-MS/MS方法,以及在丹参浸膏药液中的HPLC方法。实验结果显示,Caco-2细胞样品中:CTS与内标分离较好,线性范围为5~640ng/mL,最低定量限为5 ng/mL,标准曲线相关系数r>0.99,批内批间变异系数小于13%,方法回收率大于90%,质控样品、冻融稳定性均符合要求。大鼠血浆样品中:CTS与内标分离较好,线性范围为2.5~2400ng/mL,最低定量限为2.5ng/mL,标准曲线相关系数r>0.99,提取回收率大于70%,质控样品、冻融稳定性、基质效应均符合要求。所建立的测定方法均符合生物样品的测定要求,并具有简便、灵敏、稳定、无干扰的优点。第二部分:使药降香对君药丹参中的隐丹参酮和丹酚酸B的吸收动力学影响在整体试验上,对降香挥发油、黄酮促进CTS和SalB在大鼠体内的吸收进行了较为系统的研究。运用HPLC法对丹参浸膏中的CTS和SalB的含量进行了测定,以及用气相和气-质联用技术对降香挥发油中的含量和成分进行了检测,考察了大鼠灌服丹参浸膏和浸膏-挥发油后,CTS和SalB药代动力学过程的差异。实验结果显示:测得浸膏中CTS为1.175±0.472mg/g,SalB为26.089±4.718mg/g,用气相和气-质色谱对降香中的挥发油进行了含量和成分的测定,共鉴定出5种物质,其中橙花叔醇含量最高,经面积归一化法计算,标准品中的含量约占总挥发油的56.30% ,饱和挥发油Hanks’液中,检测出的橙花叔醇的含量约占46.53%,饱和挥发油培养基中,橙花叔醇含量49.84%。通过单药组和合药组数据统计对比显示,加入降香挥发油和柚皮素后t1/2α、t1/2β、AUC、Cmax、V1/F、CL/F有显著性差异,降香挥发油和柚皮素的存在,使CTS和SalB在体内吸收入血量增加,在体内消除减慢并向组织中分布增加,从而印证了使药降香的增效-导向作用,为降香的促吸收机制提供了依据。第三部分:降香挥发油和降香黄酮-柚皮素对隐丹参酮和丹酚酸B分别在Caco-2和MDCK细胞中的摄取影响本部分的研究目的是建立了Caco-2和MDCK细胞的药物摄取体外模型,在此模型基础上对CTS和SalB的摄取特性,及降香挥发油、柚皮素对CTS和SalB摄取特性影响进行了较系统的研究,并以细胞形态学的观察、Rh123双向转运实验进行模型验证,并在此模型上,加入CsA(50μM)考察对CTS和SalB摄取的影响。实验结果显示,Caco-2单层细胞膜具有完整性、致密性,P-gp转运体存在着明显的蛋白表达并具有良好的功能活性,揭示Caco-2细胞保持了小肠上皮细胞的特性,适用于药物摄取实验研究。CTS和SalB在Caco-2和MDCK细胞中的摄取量随时间延长而增加,37℃的CTS和SalB的摄取量明显高于4℃时的摄取量。CTS和SalB与降香挥发油分别合用后,在Caco-2细胞中CTS摄取达峰时间提前,由60min提前到45min,吸收速率加快,坪值增加,吸收程度提高,40min时摄取量增加了85.6%,60min增加了36.6%;在MDCK细胞中,由于降香挥发油的存在,CTS摄取量40min增加了61.8%,60min增加了48.7%。在CsA存在下,CTS和SalB的摄取量有增加趋势,CTS增加21%,SalB增加了16.94%,提示P-gp可能参与了CTS和SalB的摄取,CTS和SalB可能为P-gp的底物。Western Blot显示挥发油对P-gp表达基本无影响,降香黄酮具有下调P-gp表达的作用。以上结果表明,CTS和SalB的摄取具有时间、温度、浓度依赖性,CTS和SalB在小肠中的吸收机制以主动转运为为主,有被动扩散的参与;降香挥发油能非特异性的促进CTS和SalB在小肠的吸收;降香中的柚皮素能特异性的作用于P-gp,从而促进CTS和SalB在小肠的吸收。
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全文目录
中文摘要 8-11 Abstract 11-14 前言 14-15 英文缩略语 15-16 文献综述 16-23 1 化学成分 16-18 2 药理作用及机制 18-20 3 体内过程 20-21 4 配伍研究 21-22 5 展望 22-23 第一部分 隐丹参酮在生物样品中测定方法的建立 23-34 一 材料与方法 23-27 1.UPLC 法测定 Caco-2 内隐丹参酮浓度的方法建立 23-24 1.1 试剂与仪器 23 1.2 分析条件 23 1.3 细胞样品的处理 23 1.4 方法学考察 23-24 2. LC-MS/MS 法测定大鼠血浆中 CTS 浓度的方法建立 24-27 2.1 试剂与仪器 24-25 2.2 分析条件 25 2.3 实验动物 25 2.4 血浆样品的制备 25 2.5 方法学考察 25-27 二 结果 27-31 1. UPLC 法测定 Caco-2 内 CTS 浓度的方法学考证 27-29 1.1 标准曲线的制备和最低检测限 27 1.2 方法的专属性 27 1.3 方法的回收率 27-28 1.4 方法的精密度 28 1.5 冻融稳定性 28 1.6 检测方法的质控 28-29 2. LC-MS/MS 法测定大鼠血浆中 CTS 浓度的方法学考证 29-31 2.1 标准曲线与最低检测限 29 2.2 方法的专属性 29-30 2.3 提取回收率 30 2.4 方法的精密度 30 2.5 冻融稳定性 30-31 2.6 基质效应 31 2.7 检测方法的质控 31 三 讨论 31-34 1. 检测方法的选择 31-32 2. Caco-2 细胞中检测条件的选择 32 3. 血浆样品中检测条件的选择 32 4. 小结 32-34 第二部分 降香挥发油和降香黄酮-柚皮素对丹参中的隐丹参酮和丹 酚酸 B 的吸收动力学影响研究 34-50 一 材料与方法 34-39 1. 丹参浸膏中 CTS 和 SalB 含量的测定 34-35 1.1 试剂与仪器 34 1.2 供试品溶液的制备 34-35 1.3 方法学考察 35 2. 降香挥发油含量和成分的检测 35-36 2.1 仪器与试药 35-36 2.2 供试品溶液的制备 36 2.3 挥发油饱和Hanks’样品的制备 36 2.4 挥发油饱和培养基的制备 36 2.5 气相色谱试验 36 2.6 气质试验 36 3. 降香挥发油对隐丹参酮和丹酚酸B 的吸收动力学影响 36-38 3.1 试剂与仪器 36-37 3.2 实验动物 37 3.3 供试品溶液的制备 37-38 4. 柚皮素对隐丹参酮和丹酚酸B 的吸收动力学影响 38-39 4.1 试剂与仪器 38 4.2 实验动物 38 4.3 供试品溶液的制备 38 4.4 动物实验设计 38 4.5 血浆样品的制备 38-39 4.6 色谱条件 39 二.结果 39-48 1. 丹参浸膏中 CTS 和 SalB 标准曲线和最低检测限 39 2. 丹参浸膏中 CTS 和 SalB 方法的专属性 39-40 3. 丹参浸膏中丹酚酸B 和隐丹参酮的含量 40-41 4. 气相色谱试验 41-42 5. 气-质联用试验 42-44 6. 含药血浆测定结果 44 7. 降香挥发油对 CTS 和 SalB 的吸收动力学影响研究结果 44-46 8. 柚皮素对 CTS 和 SalB 的吸收动力学影响研究结果 46-48 三. 讨论 48-50 1. 丹参浸膏中 CTS 和 SalB 含量测定实验条件的选择 48 2. 气相色谱和气-质联用测定降香挥发油的成分与含量 48-49 3. 单用药与合用药的对比研究 49 4. 小结 49-50 第三部分 降香挥发油和黄酮对丹酚酸 B 和隐丹参酮分别在 Caco-2 和 MDCK 细胞中的摄取影响研究 50-68 一 材料与方法 50-57 1. 试剂、仪器与药液配制 50-52 2. Caco-2 和MDCK 细胞的培养和单层模型的建立 52 3. 蛋白印迹检测P-gp 的表达 52-53 4. P-gp 功能活性分析 53 5. 考马斯亮蓝G-250 显色法测定蛋白含量 53-54 6. 降香挥发油、丹酚酸B、隐丹参酮和柚皮素的细胞毒性试验 54 7. CTS 和 SalB 分别在 Caco-2 和 MDCK 细胞中的摄取特性 54-55 8. 降香挥发油对 CTS、SalB 在 Caco-2 和 MDCK 细胞中的摄取影响 55-56 9. 柚皮素对 SalB、CTS 在 Caco-2 和 MDCK 细胞中摄取影响 56-57 二 结果 57-65 1. CaCo-2 和 MDCK 细胞模型的建立 57 2. P-gp 蛋白表达测定 57-58 3. P-gp 功能活性分析 58 4. 考马斯亮蓝G-250 显色法测定蛋白含量 58-59 5. MTT 试验结果 59 6. CTS 和 SalB 在 CaCo-2 和 MDCK 细胞中的摄取试验 59-62 7. 蛋白印迹P-gp 的表达 62-63 8. 降香挥发油对 CTS 和 SalB 在 Caco-2 和 MDCK 细胞中的摄取影响 63-64 9. 降香挥发油和柚皮素对 CTS 和 SalB 在 Caco-2 细胞中的摄取影响对比 64-65 三 讨论 65-68 1. 细胞模型的建立 66 2. Caco-2 细胞中P-gp 的表达 66 3. CTS 和SalB 分别在Caco-2 和MDCK 模型中的摄取特性 66 4. 降香挥发油和柚皮素在细胞模型上对CTS 和SalB 摄取的影响 66-67 5. 小结 67-68 结语 68-69 致谢 69-70 参考文献 70-74
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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