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GX50对与皮肤衰老相关的NF-κB通路的调节作用

作　者: 宋肖静
导　师: 崔永萍；乔中东
学　校: 山西医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: GX50 皮肤衰老 NF-κB 表皮细胞
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 64次
引　用: 2次
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内容摘要


研究背景目前已有研究证明，尼古丁(即烟碱)可以通过激活α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nicotin acetylcholine receptor，α7nAChR）来抑制核因子κB（nuclear transcriptionfator-kappa B，NF-κB）信号通路，从而预防老年痴呆症[1]。但尼古丁会使人上瘾，重复使用尼古丁会加快心脏速度和升高血压并降低食欲。大剂量的尼古丁会引起恶心呕吐，严重时会致死。由于α7nAChR是尼古丁的主要效应部位，魏冬青教授针对尼古丁发挥作用的α7nAChR，采用生物信息学方法设计并筛选得到一种化合物GX50。GX50是花椒中的一种天然组分，使用安全。我们实验室前期研究发现，GX50对巨噬细胞、神经细胞和内皮细胞中的NF-κB信号通路都具有调节作用，为了探究它对皮肤衰老的作用，我们以皮肤为模型，研究GX50对皮肤衰老及NF-κB信号通路的作用，为该化合物应用于临床做准备。有文献表明哺乳动物老化普遍与NF-κB有关，证明年老皮肤中NF-κB被严重阻断能逆转许多老化特征[2]。已证实人类和小鼠的许多组织中转录因子NF-κB可能是与老化有关的转录变化的活化剂。年龄性衰老小鼠皮肤的NF-κB基因被阻断，能使整体基因表达程序逆转到年轻时的状态，在形态学上表型也会恢复到年轻时候的状态[3]。目的探究GX50对皮肤衰老及NF-κB信号通路的作用，为该化合物应用于临床做准备。方法为了探究GX50在皮肤衰老中的作用，我们主要从组织水平和细胞水平两方面进行研究。在组织水平上，进行了涂药实验，给老年小鼠背部皮肤左侧涂抹溶于二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和甘油中的GX50，右侧只涂DMSO和甘油做对照，两周后剪取两侧皮肤制作冰冻切片。首先进行HE染色，比较实验组和对照组皮肤的差别。为进一步说明两侧皮肤的区别，我们选择胶原蛋白抗体进行免疫组化染色，比较实验组和对照组胶原蛋白表达量。为了探究GX50促使皮肤年轻化的作用靶点是否也是NF-κB信号通路，对实验组和对照组皮肤进行了电泳迁移率分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）实验，通过测定NF-κB入核量，来检验NF-κB的活性。使用Western Blot的方法对皮肤组织浆蛋白进行检测，检验标准是NF-κB信号通路中NF-κB的抑制因子I-κB磷酸化的程度。在细胞水平上，进行小鼠表皮细胞的原代培养并选取广谱角蛋白（PanCytokeratin，PCK）一抗进行免疫荧光染色鉴定其纯度。对细胞进行GX50、脂多糖（lipopolysacharide，LPS）和空白对照（Blank）处理，然后提取表皮细胞膜蛋白、核蛋白和浆蛋白，并在紫外分光光度计下对所提蛋白进行浓度测定。药物设计方法已经发现GX50能有效地激活α7nAChR，应用Octet RED生物相互作用分析仪，检测GX50与表皮细胞膜α7nAChR的结合能力。通过EMSA来检测表皮细胞NF-κB的活性。通过Western Blot来检测IκB磷酸化的程度。结果（1）小鼠皮肤组织切片HE染色结果显示：表皮部分，左侧比右侧平坦，基底层细胞大小、形态较规整，胞外基质排列较紧密；真皮部分，左侧比右侧毛囊多而密，黑素细胞数目较多，黑色素沉积较少；表皮与真皮的交界处，左侧皮肤交界比较明显，表皮与真皮的连接比较牢固。（2）小鼠皮肤组织切片免疫组化结果发现左侧比右侧的胶原蛋白表达明显增加（P＜0.05）。（3）小鼠皮肤组织EMSA结果显示涂有GX50的皮肤组织中入核的NF-κB蛋白量比对照组有所降低（P＜0.05），从而证实GX50对NF-κB的活化有一定的抑制作用。(4)小鼠皮肤组织Western Blot结果显示在实验组比对照组上样量多的情况下，对照组有隐约的p-IκB的条带，而涂有GX50的实验组没有看到条带。通过内参校正，认为GX50可能抑制了I-κB的磷酸化，从而阻遏了NF-κB的活化，使其对下游靶基因的调节减弱。（5）受体结合曲线趋势说明GX50对皮肤调节作用的靶点可能就是α7nAChR。（6）EMSA滞后带灰度分析说明表皮细胞GX50组NF-κB的入核量低于空白对照组（P＜0.05），说明GX50降低了NF-κB的活性。（7）结果显示GX50组的细胞浆蛋白中的IκB高于空白对照组（P＜0.05），而GX50组的细胞浆蛋白中的p-IκB低于空白对照组（P＜0.05）。这个结果说明GX50抑制了IκB的磷酸化。结论综合细胞水平、组织水平上的实验，可以初步认为GX50是通过α7nAChR来调节与皮肤衰老相关的NF-κB通路，从而使得皮肤变的年轻化。

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