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bISG15在BIV潜伏感染中作用初探

作　者: 刘畅
导　师: 耿运琪
学　校: 南开大学
专　业: 微生物学
关键词: bISG15 BIV 慢病毒 潜伏感染 超感染
分类号: Q939.4
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


潜伏感染是慢病毒逃脱宿主免疫监视和免疫清除的重要机制。宿主通过先天免疫以及获得性免疫抵抗外界病毒的感染。干扰素调节是先天免疫的重要组成部分,干扰素可以诱导一系列干扰素刺激基因的大量表达。干扰素刺激基因所编码干扰素刺激蛋白的高水平表达可以抑制病毒的复制,这种抑制是导致慢病毒建立潜伏感染的原因之一。诸多外界因素可以影响慢病毒的感染状态,使慢病毒由潜伏感染转向裂解感染。其中其他病毒与慢病毒的超感染便是影响因素之一,其他病毒的超感染往往可以促进慢病毒的复制。本研究以牛免疫缺陷病毒(BIV)为慢病毒模型,对一种干扰素刺激蛋白ISG15在BIV潜伏感染中的作用进行了初步的探讨。ISG15是一种可以被Ⅰ型干扰素诱导表达的小分子蛋白,属于类泛素修饰蛋白家族。与泛素类似,ISG15可以共价地连接到一些蛋白上,进行蛋白的翻译后修饰,该修饰称之为蛋白质的ISGylation修饰。ISG15以及ISGylation修饰参与多种重要的生物学过程,其中包括:先天免疫、肿瘤发生以及怀孕建立等。各种属间ISG15的氨基酸序列同源性并不高。目前,对于牛ISG15(bovineISG5,bISG15)的研究主要集中于其在母牛怀孕的建立方面,而bISG15在先天免疫以及抗病毒方面的研究基本上是空白。我们首先建立了bISG15的相关检测体系,包括bISG15的体外启动子Luciferase报告系统、bISG15 mRNA的RT-PCR检测系统以及bISG15表达的Western-blot检测系统等。在此基础上,对bISG15在胎牛肺细胞(FBLs,一种BIV的饲养细胞)中的表达、BIV与bISG15的相互影响(包括BIV感染对bISG15表达水平的影响、bISG15对BIV复制的抑制、BIV调控蛋白bTat对bISG15抑制的抵抗等)进行了初步的研究。最后,我们研究了RNA病毒牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和DNA病毒牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)对bISG15表达的影响,并对其分子机制进行了初步探讨。本文获得了以下重要结果及结论:1.通过RT-PCR以及Western-blot检测系统证实,FBLs中bISG15本底表达水平不高,但通过poly I:C或LPS刺激可以引起bISG15表达水平的上调;2.通过免疫荧光以及染色体免疫沉淀实验证实,FBLs中bISG15表达水平的上调与干扰素调节因子3(IRF-3)密切相关,并通过体外转染实验证明IRF-3过表达可以激活bISG15的启动子;3.BIV感染FBLs,可以引起bISG15的少量上调,而随感染进行bISG15的增加表达水平逐渐下降;4.bISG15参与细胞的抗病毒过程,可以抑制BIV的复制,说明bISG15在BIV建立潜伏感染的过程中发挥一定作用;另一方面,BIV又可抑制bISG15的表达,该抑制作用可能与BIV的调控蛋白Tat有关;5.BVDV和BHV-1感染FBLs可以抑制bISG15表达的本底水平,而BHV-1的即早期蛋白bICP0可以抑制IRF-3对bISG15启动子的激活,据此推测,BVDV和BHV-1超感染可以通过抑制干扰素通路促进BIV的复制。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章 引言  14-48
  第一节 慢病毒潜伏感染以及相关病毒介绍  14-23
    1.1.1 慢病毒及其生活周期  14-17
    1.1.2 慢病毒潜伏感染及影响潜伏感染的因素  17-18
    1.1.3 本文所涉及的相关病毒  18-23
  第二节 干扰素诱导的抗病毒效应因子  23-32
    1.2.1 干扰素系统概述  23-25
    1.2.2 Mx GTPase系统  25-27
    1.2.3 OAS和RNaseL通路  27-29
    1.2.4 RNA依赖的蛋白激酶PKR  29-31
    1.2.5 类泛素修饰蛋白ISG15  31-32
  第三节 类泛素修饰蛋白ISG15  32-45
    1.3.1 类泛素修饰蛋白  32-33
    1.3.2 ISG15的发现历史  33
    1.3.3 细胞外的ISG15  33-34
    1.3.4 ISG15表达的调节  34-36
    1.3.5 ISG15修饰酶系统  36-39
    1.3.6 ISG15修饰的靶蛋白  39-41
    1.3.7 ISG15及其修饰在免疫过程中的作用  41-43
    1.3.8 牛ISG15(bISG15)及其生物学功能  43-45
  第四节 本研究的目的和意义  45-48
    1.4.1 本研究的前期基础  45-46
    1.4.2 本研究的目的和意义  46-48
第二章 材料与方法  48-62
  第一节 实验材料  48-50
    2.1.1 细胞与病毒  48
    2.1.2 菌株  48-49
    2.1.3 质粒  49-50
    2.1.4 酶类  50
    2.1.5 其他试剂  50
  第二节 实验方法  50-62
    2.2.1 基因操作  50-52
      2.2.1.1 质粒DNA提取  50
      2.2.1.2 细胞基因组DNA提取  50
      2.2.1.3 细胞RNA提取以及反转录  50
      2.2.1.4 DNA的酶切和连接  50-51
      2.2.1.5 E.coli感受态细胞的制备和转化  51
      2.2.1.6 引物设计及合成  51-52
    2.2.2 蛋白的表达与纯化  52-53
      2.2.2.1 重组蛋白质表达  52
      2.2.2.2 金属螯合层析  52-53
      2.2.2.3 蛋白质的浓缩  53
      2.2.2.4 蛋白质浓度的测定  53
    2.2.3 细胞相关实验  53-57
      2.2.3.1 胎牛肺细胞分离培养  53-54
      2.2.3.2 细胞培养  54
      2.2.3.3 病毒培养以及滴度的测定  54
      2.2.3.4 质粒转染  54-55
      2.2.3.5 荧光素酶活性测定(Luciferase)  55
      2.2.3.6 内对照系统  55-56
      2.2.3.7 siRNA干扰  56
      2.2.3.8 BIVL指示细胞病毒测定  56-57
    2.2.4 Western Blot  57
      2.2.4.1 SDS-PAGE电泳  57
      2.2.4.2 转膜  57
      2.2.4.3 杂交  57
    2.2.5 RT-PCR  57-58
      2.2.5.1 细胞RNA提取与反转录  57-58
      2.2.5.2 Real-time PCR  58
    2.2.6 免疫荧光  58-59
    2.2.7 染色体免疫共沉淀  59-60
    2.2.8 bISG15体外修饰系统的建立  60
    2.2.9 内毒素测定  60-61
    2.2.10 数据及生物信息学分析  61-62
第三章 结果与分析  62-90
  第一节 bISG15检测的系统建立  62-69
    3.1.1 bISG15的RT-PCR检测系统优化  62-64
    3.1.2 bISG15启动子报告系统的建立  64-66
    3.1.3 bISG15抗体的制备以及Western blot检测系统建立  66-69
  第二节 胎牛肺细胞(FBLs)中bISG15的表达研究  69-77
    3.2.1 LPS/polyI:C诱导bISG15的转录和表达  70-74
    3.2.2 IRF3参与激活bISG15的表达  74-77
  第三节 BIV与bISG15的相互影响  77-86
    3.3.1 BIV感染可以诱导bISG15的表达  77-80
    3.3.2 bISG15可以抑制BIV复制  80-83
    3.3.3 BIV的Tat蛋白可以抑制IRF-3对bISG15启动子的激活  83-86
  第四节 BHV-1、BVDV感染抑制bISG15表达  86-90
    3.4.1 BHV-1、BVDV感染抑制bISG15表达  86-88
    3.4.2 BHV-1的即早期蛋白bICP0抑制IRF-3对bISG15启动子的激活作用  88-90
第四章 讨论  90-96
  第一节 bISG15在先天免疫中的作用  90-92
  第二节 bISG15与BIV的相互"对抗"  92-94
  第三节 BHV-1、BVDV超感染对BIV的影响  94-95
  第四节 有待进一步研究的科学问题  95-96
第五章 结论  96-98
参考文献  98-112
致谢  112-113
附录  113-122
  A.利用蛋白质组学分析与BIV的MA相互作用蛋白  113-116
  B.个人简历  116-117
  C.在学期间发表的学术论文  117-118
  D.英文缩写  118-120
  E.图表索引  120-122

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物分类学（系统微生物学） > 病毒（滤过性病毒）
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