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人参皂苷Rb1及Rg3上调神经内肽酶表达抑制β-淀粉样肽神经毒性作用的研究

作　者: 杨玲玲
导　师: 崔行
学　校: 山东大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 阿尔茨海默症神经内肽酶人参皂苷 β-淀粉样肽
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

阿尔茨海默症是一种原发性神经元退行性疾病,是老年人群痴呆的最重要类型。阿尔茨海默症患者的典型病理表现为:脑内神经细胞间老年斑形成,神经细胞内神经纤维缠结,选择性神经元或突触丢失。阿尔茨海默症发病机制至今不清,但绝大多数研究者认同阿尔茨海默症是一种由于基因缺陷直接或间接改变淀粉样蛋白前体表达或蛋白酶解过程从而影响β-淀粉样肽聚集稳定性的病理综合征。β-淀粉样肽,为39～43个氨基酸组成的一组多肽,是老年斑的主要成分,也是阿尔茨海默症的主要致病物质,由淀粉样蛋白前体经β-、γ-分泌酶次序降解产生,可被某些肽酶降解清除。正常情况下,β-淀粉样肽的产生和清除处于平衡状态,但某些致病因素可致平衡失调,导致β-淀粉样肽累积并逐渐形成不溶性纤维丝,从而引发连串的复杂反应,包括钙离子稳态失调,氧自由基生成增加,tau蛋白磷酸化,递质变化,突触丢失,神经胶质增生和炎症反应等,最终出现神经元功能失调,死亡,斑块形成,神经原纤维缠结等病理现象。因而,抑制β-淀粉样肽生成、促进β-淀粉样肽清除、降低β-淀粉样肽毒性和促进神经元损伤后的修复等可作为阿尔茨海默症药物研究的重要靶标。近年来研究表明,神经内肽酶是脑内催化β-淀粉样肽降解的关键酶,是调节大脑β-淀粉样肽水平的重要因素。因此,本课题以神经内肽酶为靶点,对十余种已有研究表明对神经系统损伤有一定改善作用的天然药物进行研究;并构建高表达瑞典突变型淀粉样肽前体蛋白的神经母细胞瘤细胞作为阿尔茨海默症细胞模型,在细胞水平检测药物对β-淀粉样肽的降解作用及神经保护作用;克隆神经内肽酶基因启动子区域,初步探讨药物调节神经内肽酶活性的分子机制。第一部分筛选能够提高神经内肽酶活性的药物【研究目的】获得能够提高神经内肽酶活性的天然药物。【研究方法】（1） MTT试验检测各天然药物对神经母细胞瘤细胞SK-N-SH细胞存活率的影响,确定药物的最佳浓度及作用时间。（2）肽酶实验检测各天然药物对细胞神经内肽酶活性的影响。（3）肽酶实验分别检测不同浓度及不同时间情况下人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg3对神经内肽酶活性的影响。【结果】（1）药物浓度梯度实验结果表明:茶多酚10mg/L;维生素E 25mg/L;槲皮素5μmol/L;芦丁20mg/L;大黄素2mg/L;白藜芦醇5μmol/L;姜黄素5μmol/L;葛根素100μmol/L;石杉碱甲5μmol/L;人参皂苷Rg120μmol/L;人参皂苷Rb1 50μmol/L;人参皂苷Rg3 50μmol/L;人参皂苷Re 50μmol/L;远志皂苷元50μmol/L;知母皂苷A3 1mg/L对细胞存活无明显影响或影响较小。药物时间梯度实验结果表明,有效作用时间为48～72h。（2）茶多酚、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3能够明显提高神经内肽酶活性,分别为未处理细胞的（117±2.8）%、（131±4.0）%、（121±1.6）%倍。（3） 20μmol/L人参皂苷Rb1即能有效提高神经内肽酶活性,为未处理组的（120±7.9）%;药物浓度达到100μmol/L时作用最强,为（131±2.3）%。选用50μmol/L人参皂苷Rb1进行时间梯度试验,结果显示药物作用72h效果最佳,为（126±3.5）%。（4） 25μmol/L人参皂苷Rg3即能有效提高神经内肽酶活性（117±4.5）%,药物浓度达到100μmol/L时作用最强,为（140±8.5）%。选用50μmol/L人参皂苷Rg3进行时间梯度检测,结果显示药物作用72h效果最佳,为（129±1.3）%。【结论】确定了各天然药物的最佳浓度及作用时间。茶多酚、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg3能够提高神经内肽酶活性。人参皂苷Rb1对神经内肽酶活性的影响呈一定浓度梯度和时间梯度关系,100μmol/L时作用最强,最佳作用时间为72h。人参皂苷Rg3对神经内肽酶活性的影响亦呈一定浓度梯度和时间梯度关系,100μmol/L时作用最强,最佳作用时间为72h。第二部分表达瑞典突变型APP695的SK-N-SH细胞的制备与鉴定以及人参皂苷Rb1和Rg3的神经保护作用的研究【研究目的】构建含瑞典突变型淀粉样蛋白前体sweAPP695基因的表达载体;建立表达sweAPP695蛋白的SK-N-SH细胞株;检测APP695蛋白表达变化、β-淀粉样肽分泌能力及生物学性状变化;检测人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg3的神经保护作用。【研究方法】（1）构建含sweAPP695基因的表达质粒（pcDNA3.1-sweAPP695）,酶切鉴定并测序。（2）以脂质体Lipofectamine^TM2000介导重组质粒pcDNA3.1-sweAPP695转染神经母细胞瘤细胞SK-N-SH,利用G418进行筛选,3-4周后,挑取单克隆、消化接种后继续培养建株,以Western Blot及酶联免疫吸附试验鉴定。（3）分别抽提SK-N-SH细胞及转染后细胞蛋白,Western Blot检测细胞sweAPP695蛋白表达情况。（4）分别收集SK-N-SH细胞及转染后细胞的上清液,酶联免疫吸附试验检测细胞分泌Aβ₄₀和Aβ₄₂情况。（5）将通过鉴定能够稳定表达sweAPP695蛋白的细胞株命名为sweAPP-SK细胞,作为阿尔茨海默症模型细胞进行实验。观察细胞形态学改变,利用MTT试验测定细胞生长增殖能力,绘制细胞生长曲线。（6）利用活性氧探针H₂DCFD标记SK-N-SH细胞及sweAPP-SK细胞,流式细胞术检测,分析转染sweAPP695后细胞内活性氧水平变化。（7）利用钙离子探针Fluo-3AM ester标记SK-N-SH细胞及sweAPP-SK细胞,流式细胞术检测,分析转染sweAPP695后细胞内钙离子水平变化。（8）分别收集SK-N-SH细胞及sweAPP-SK细胞,流式细胞术检测,分析转染sweAPP695后细胞凋亡情况。（9）分别以50μmol/L人参皂苷Rb1和50μmol/L人参皂苷Rg3处理sweAPP-SK细胞72h,收集细胞的上清液,酶联免疫吸附试验检测细胞外Aβ₄₀和Aβ₄₂,分析药物作用。（10）分别以50μmol/L人参皂苷Rb1和50μmol/L人参皂苷Rg3处理sweAPP-SK细胞72h,活性氧探针标记细胞,流式细胞术检测,分析药物对细胞内活性氧水平的影响。（11）分别以50μmol/L人参皂苷Rb1和50μmol/L人参皂苷Rg3处理sweAPP-SK细胞72h,钙离子探针标记细胞,流式细胞术检测,分析药物对细胞内钙离子水平的影响。（12）以20μmol/L外源Aβ_25-35作用SK-N-SH细胞48h,建立细胞凋亡模型;并分别以50μmol/L人参皂苷Rb1和50μmol/L人参皂苷Rg3处理细胞72h;收集细胞,流式细胞术进行检测,分析药物对于细胞凋亡的影响。（13）以20μmol/L外源Aβ_25-35作用于细胞建立细胞凋亡模型;并分别以50μmol/L人参皂苷Rb1和50μmol/L人参皂苷Rg3处理细胞72h;抽提细胞总蛋白,Western Blot检测药物对于细胞促凋亡蛋白Bax及抑凋亡蛋白Bcl-2表达的影响。【结果】（1）经限制性内切酶酶切鉴定,sweAPP695基因片段大小符合,插入方向正确;DNA测序显示序列正确。（2） Western Blot结果显示:筛选到的模型细胞高水平表达sweAPP695蛋白。（3）酶联免疫吸附试验结果显示:筛选到的模型细胞上清液中Aβ₄₀及Aβ₄₂浓度明显升高,分别为转染前的7.26和3.27倍（P＜0.05）。（4）将经过鉴定的细胞命名为sweAPP-SK细胞,并作为阿尔茨海默症模型细胞用于后续药物作用分析实验。（5） sweAPP-SK细胞较正常SK-N-SH细胞体积变大,生长变缓。（6）活性氧探针标记后流式细胞术检测结果显示:sweAPP-SK细胞内氧自由基水平升高,为正常SK-N-SH细胞的2.48倍。（7）钙离子探针标记后流式细胞术检测结果显示:sweAPP-SK细胞内钙离子水平升高,为正常SK-N-SH细胞的2.76倍。（8）流式细胞术凋亡检测结果显示sweAPP-SK细胞虽生长变缓,但没有显著的细胞凋亡发生。（9）酶联免疫吸附试验结果显示:经50μmol/L人参皂苷Rb1作用72h后,sweAPP-SK细胞培养基中Aβ₄₀和Aβ₄₂水平明显降低,为未处理细胞组的（74±1.61）%和（99±3.31）%;经人参皂苷Rg3作用72h后,细胞培养基中Aβ₄₀和Aβ₄₂水平亦明显降低,为未处理细胞组的（83±5.31）%和（76±6.74）%。（10）活性氧检测结果显示:经50μmol/L人参皂苷Rb1作用72h后,sweAPP-SK细胞内活性氧水平明显降低,荧光强度由437.67降至282.70;经50μmol/L人参皂苷Rg3作用72h后,sweAPP-SK细胞内活性氧水平明显降低,荧光强度由437.67降至271.19。（11）钙离子检测结果显示:经50μmol/L人参皂苷Rb1作用72h后,sweAPP-SK细胞内钙离子浓度明显降低,荧光强度由109.85降至64.35;经50μmol/L人参皂苷Rg3作用72h后,sweAPP-SK细胞内钙离子浓度明显降低,荧光强度由109.85降至71.85。（12）细胞凋亡检测结果显示:20μmol/L外源Aβ_25-35作用细胞48h,细胞出现明显凋亡,凋亡率为13.4%,经50μmol/L人参皂苷Rb1作用72h后,细胞凋亡率降至0.40%;经50μmol/L人参皂苷Rg3作用72h后,细胞凋亡率降至0.36%。（13） Western Blot检测结果显示:人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg3均能抑制细胞内促凋亡蛋白Bax的基因表达,从而抑制细胞凋亡发生。但对bcl-2基因表达无明显影响。【结论】成功构建了含sweAPP695基因的表达质粒（pcDNA3.1-sweAPP695）;并筛选出能够高表达sweAPP695蛋白的阿尔茨海默症模型细胞sweAPP-SK,此细胞能够高水平分泌Aβ₄₀和Aβ₄₂致使细胞内活性氧水平及钙离子水平升高,但其毒性不致引起明显的细胞凋亡。人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3均能有效降低细胞外Aβ₄₀和Aβ₄₂浓度;人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3均能有效降低细胞内活性氧水平;人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3均能有效降低细胞内钙离子水平;人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3能通过抑制促凋亡蛋白Bax的基因表达从而抑制细胞发生凋亡。第三部分工作人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3升高神经内肽酶活性机制的研究【研究目的】研究人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3升高神经内肽酶活性的机制。【研究方法】（1）分别以人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3处理细胞,抽提细胞蛋白,WesternBlot技术从蛋白水平检测人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg3对细胞神经内肽酶基因表达的影响。（2）分别以人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3处理细胞,抽提细胞RNA,逆转录PCR从mRNA水平检测人参皂苷Rb1对细胞神经内肽酶基因表达的影响;实时定量PCR从mRNA水平检测人参皂苷Rg3对细胞神经内肽酶基因表达的影响。（3）克隆人神经内肽酶neprilysin基因5’上游区域2.9Kb启动子片段（-2268-+708）,构建2.9Kb启动子-荧光素酶报道基因质粒（pGL3-nep2.9Kb）,利用脂质体将pGL3-nep2.9Kb质粒和内参照质粒pRL-TK共转染SK-N-SH细胞,荧光素酶报道基因分析检测启动子活性。（4）将pGL3-nep2.9Kb进行酶切改造,去除转录起始点下游+144-+708片段,获得pGL3-nep2.4Kb质粒。利用脂质体将pGL3-nep2.4Kb质粒和内参照质粒pRL-TK共转染SK-N-SH细胞,荧光素酶报道基因分析检测启动子活性。（5）pGL3-nep2.4Kb质粒和内参照质粒pRL-TK共转染SK-N-SH细胞后分别用50μmol/L人参皂苷Rb1和50μmol/L人参皂苷Rg3处理细胞48h,进行荧光素酶报道基因分析试验,检测药物对启动子活性的影响。【结果】（1） Western Blot结果显示:经人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg3作用后,细胞内神经内肽酶表达量明显增高,呈剂量依赖。（2）逆转录PCR结果显示:经人参皂苷Rb1作用后,细胞内neprilysin基因转录增高,呈剂量依赖。（3）实时定量PCR结果显示:经人参皂苷Rg3作用后,细胞内neprilysin基因转录增高。25μmol/LRg3作用细胞72h可使细胞内neprilysin基因表达升至1.88±0.26倍,而50μmol/LRg3作用细胞48h可使细胞内neprilysin基因表达升至2.93±0.55倍（P＜0.05）。（4）经限制性内切酶酶切鉴定,克隆的2.9kb启动子片段大小符合,插入方向正确;DNA测序结果正确。荧光素酶报道基因分析结果显示:2.9Kb启动子片段无明显启动子活性。（5） DNA测序结果表明:经SmaI与XhoI酶切改造的2.4Kb启动子片段序列正确。荧光素酶报道基因分析结果显示:2.4Kb启动子片段具有启动子活性,其启动子活性为pGL3-basic活性的10倍。（6）荧光素酶报道基因分析结果显示:人参皂苷Rb1可增强启动子活性,为未处理组启动子活性的1.46倍;人参皂苷Rg3亦可增强启动子活性,为未处理组启动子活性的1.40倍。【结论】人参皂苷对neprilysin基因表达的影响发生在转录水平。克隆的2.9Kb片段位于neprilysin基因-2268bp至+708bp区域;改造后的2.4Kb片段位于neprilysin基因-2268bp至+144bp区域。2.9Kb启动子片段无明显启动活性;2.4Kb启动子片段在神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中显示有明显的启动子活性。人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg3能提高启动子活性从而促进neprilysin基因表达,进而提高酶活性。后续工作中将研究药物对启动子活性调节的具体机制。

全文目录

中文摘要  10-18
英文摘要  18-27
符号说明  27-28
前言  28-31
第一部分筛选能够提高神经内肽酶活性的药物  31-43
  材料  31-32
  方法  32-33
    细胞的培养  32
    MTT试验  32
    神经内肽酶活性检测  32-33
    统计学处理  33
  结果  33-39
    最佳药物浓度及作用时间的确定  33-35
    各天然药物对神经内肽酶活性的影响  35
    人参皂苷Rb1与Rg3对神经内肽酶活性的影响  35-39
  讨论  39-42
  第一部分总结  42-43
第二部分表达瑞典突变型APP695的SK-N-SH细胞的制备与鉴定以及人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg3神经保护作用的研究  43-73
  材料  43-45
  方法  45-56
    瑞典突变型APP695表达载体pcDNA3.1-sweAPP695的构建  45-48
    细胞的培养  48-49
    细胞转染实验  49
    Western Blot检测  49-51
    酸联免疫吸附试验检测Aβ_(42)和Aβ_(40)分泌情况  51-54
    流式细胞术检测细胞内氧自由基水平  54
    流式细胞术检测细胞内钙离子水平  54-55
    流式细胞术检测细胞凋亡  55-56
    统计学处理  56
  结果  56-65
    pcDNA3.1-sweAPP695重组质粒的鉴定  56-58
    Western Blot检测转染后sweAPP695蛋白的表达  58-59
    ELISA检测转染后细胞外Aβ_(42)和Aβ_(40)浓度  59-60
    sweAPP-SK细胞增殖能力变化  60
    sweAPP-SK细胞凋亡检测及人参皂苷Rb1与Rg3对细胞凋亡的影响  60-61
    sweAPP-SK细胞内活性氧水平检测及人参皂苷Rb1与Rg3对细胞内活性氧水平的影响  61-63
    sweAPP-SK细胞内钙离子水平检测及人参皂苷Rb1与Rg3对细胞内钙离子水平的影响  63-64
    人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg3对凋亡相关蛋白的影响  64-65
  讨论  65-72
  第二部分总结  72-73
第三部分人参皂苷Rb1及人参皂苷Rg3升高神经内肽酶活性机制的研究  73-99
  材料  73-75
  方法  75-90
    细胞的培齐  75
    Western Blot检测  75-78
    实时定量PCR及逆转录PCR检测  78-80
    人nep基因转录起始点上游2.9Kb调控序列的扩增  80-82
    2.9Kb启动子片段的T-载体亚克隆  82-84
    荧光素酶报道基因载体pGL3-nep2.9Kb质粒的构建  84-86
    荧光素酶报道基因载体pGL3-nep2.4Kb质粒的构建  86-88
    细胞转染实验  88-89
    双荧光素酶活性测定  89-90
  结果  90-95
    蛋白水平检测人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3对nep基因表达的影响  90-91
    RNA水平检测人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg3对nep基因表达的影响  91
    荧光素酶报道基因载体-nep启动子( pGL3-nep2.9Kb)启动子质粒的鉴定  91-94
    荧光素酶报道基因载体-nep启动子(pGL3-nep2.4Kb)启动子质粒的鉴定  94
    人参皂Rb1与Rg3对pGL3-nep2.4Kb启动子活性影响  94-95
  讨论  95-97
  第三部分总结  97-99
附图  99-109
参考文献  109-117
致谢  117-118
攻读博士学位期间发表的学术论文目录  118-119
学位论文评阅及答辩情况表  119-120
已发表英文文章  120-130

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