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MicroRNA在子痫前期胎盘组织中的表达及功能研究

作　者: 朱晓明
导　师: 姚元庆；王雁玲
学　校: 第四军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: 子痫前期胎盘微小RNA 人类白细胞抗原-G
分类号: R714.241
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

子痫前期(Preeclampsia, PE)是人类妊娠期特有的常见病和多发病。在我国,其发生率为9.7%,在孕产妇死亡原因中占第二位,严重威胁母婴健康[1]。目前,PE的病因和发病机理仍未阐明,研究表明胎盘滋养细胞功能障碍是PE发病的病理基础。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约22个核苷酸的单链非编码RNA,通过与靶mRNA完全或不完全互补配对,导致靶基因降解或抑制其翻译,从而在基因的表达调控中发挥着重要作用。最近有研究表明在人类子痫前期胎盘与正常胎盘组织中,miR-210与miR-182的表达水平存在差异[2],提示miRNA的表达失衡可能参与了PE的发病过程。但以往研究检测的miRNA数量有限,并且国内外尚无miRNA在PE胎盘组织中功能研究的报告。因此有必要深入开展miRNA在PE胎盘组织中的表达和功能研究,为深入研究PE的发病机理提供新的线索。目的1.了解miRNA在正常与PE胎盘组织中的表达差异,进一步筛选与PE发病相关的miRNA。2.了解miRNA的作用靶点以及对胎盘滋养细胞功能的调控作用,探讨miRNA在PE发生发展中的作用。方法1.应用Exiqon 8.1版的miRNA表达谱芯片筛选8对重度PE胎盘与正常胎盘组织中差异表达的miRNA,并采用TargetScan与PITA预测系统筛选差异miRNA的靶基因。2.选取10个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)方法加以验证,分别定量检测miRNA在15例重度子痫前期患者(sPE组)、8例轻度子痫前期患者(mPE组)及11例正常妊娠胎盘组织(对照组)中的表达水平。3.选择PE与正常胎盘组织中表达差异较为显著的miR-152进行靶基因验证。采用miRNA过表达技术在人滋养细胞肿瘤细胞系(JEG-3)中过表达miR-152,RT-PCR与免疫印迹(Western blot)技术验证其靶基因的表达水平,并通过荧光素酶报告系统进一步验证其作用位点。4.在JEG-3细胞中过表达miR-152,检测JEG-3细胞浸润能力的变化,并检测NK-92MI细胞杀伤JEG-3细胞的能力是否改变。结果1.芯片结果显示:重度子痫前期胎盘与正常胎盘组织中存在34个差异表达的miRNA,其中,11个miRNA在sPE胎盘组织中表达升高,23个miRNA表达下降。通过靶基因预测发现:在miR-30a-3p、miR-152与miR-18a的可能的作用靶点中,分别包括IGF1、HLA-G与ESR1等与PE发病相关的基因。2.选取10个miRNA,应用Real-time RT-PCR进行验证,其中8个miRNA与芯片结果相符:miR-210、miR-152与miR-518b在sPE胎盘中表达升高(P<0.05),miR-377、miR-411、miR-542-3p、miR-18a与miR-363在sPE胎盘中表达下降(P<0.05);miR-152在mPE胎盘组织中表达升高(P<0.05),miR-210、miR-377、miR-411在mPE中表达下降(P<0.05)。3.将pre-miR-152转染入JEG-3细胞,使JEG-3细胞中的miR-152表达升高,RT-PCR结果显示转染前后JEG-3细胞中HLA-G mRNA的水平无显著差异(P>0.05),但Western blot结果发现在JEG-3中过表达miR-152之后,HLA-G的蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。采用pMIR-REPORT荧光素酶报告基因系统进行靶点验证,结果显示转染pre-miR-152与重组载体的实验组其荧光素酶活性下降约47%,表明HLA-G为miR-152的作用靶点。4.细胞浸润实验发现过表达miR-152前后,JEG-3细胞的浸润能力无显著改变(P>0.05)。然而,在JEG-3细胞中过表达miR-152之后,NK-92MI细胞对JEG-3细胞的杀伤能力显著提高(P<0.05)。结论1.子痫前期胎盘组织中存在一系列表达失衡的miRNA,这一异常可能参与了子痫前期的发生和病理生理过程。2.实验结果显示HLA-G为miR-152的作用靶点,表明miR-152可能通过调控免疫耐受因子HLA-G的表达参与了子痫前期的发生。3. miR-152可以通过降低靶基因HLA-G的表达,从而提高NK细胞对滋养细胞的杀伤作用,为基因治疗在子痫前期与绒毛膜癌等疾病中的应用奠定了理论与实验基础。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-15
文献回顾  15-37
正文  37-88
  实验一 PE与正常胎盘组织中差异miRNA表达谱的筛选  37-53
    1 材料  37-38
    2 方法  38-44
    3 结果  44-50
    4 讨论  50-53
  实验二 PE相关miRNA-miR-152的功能分析  53-76
    1 材料  53-56
    2 方法  56-66
    3 结果  66-73
    4 讨论  73-76
  小结  76-77
  参考文献  77-88
附录  88-106
  子宫蜕膜条件培养液对滋养细胞浸润功能的影响  88-106
    前言  88-89
    1 材料  89
    2 方法  89-93
    3 结果  93-100
    4 讨论  100-101
    5 小结  101
    6 参考文献  101-106
个人简历和研究成果  106-107
致谢  107

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