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重组腺病毒载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-βNGF的构建和鉴定

作　者: 赵国庆
导　师: 肖哲
学　校: 汕头大学
专　业: 外科学
关键词: 小鼠神经生长因子腺病毒载体绿色荧光蛋白基因治疗
分类号: R651.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:目前脑外伤治疗的方向越来越倾向于基因治疗，其中病毒作为载体约占了85%，因此重组病毒载体成为基因治疗的关键。目的：构建携带绿色荧光蛋白(green flurrescent protein ,GFP)标记小鼠神经生长因子（nervegrowth factor，βNGF）基因重组腺病毒载体。材料：①动物：成年雄性健康昆明小白鼠2只（体重60-70g），购自广州军区广州总医院动物实验中心，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②质粒、菌株：腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV（已标记绿色荧光蛋白）、骨架质粒pAdeasy-1、大肠杆菌BJ5183和DH5α均购自stratagene。③主要酶和试剂：限制性内切酶PacⅠ，PmeⅠ（NEB）；反转录试剂盒，质粒提取试剂盒，凝胶回收试剂盒，T4 DNA连接酶，TaqDNA聚合酶，限制性内切酶Kpn I和Xho I（Takara）；Trizol（Invitrogen）；cDNA引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成；测序由广州赢森生物科技有限公司完成。方法：利用RT-PCR从小鼠颌下腺总mRNA中扩增βNGF全长cDNA片断，定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV（已标记绿色荧光蛋白）中；在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组，构建pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-βNGF，重组腺病毒表达载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-βNGF的酶切鉴定。结果：经RT-PCR，序列测定及限制性内切酶的酶切分析，证明构建腺病毒载体。pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-βNGF成功。结论：成功构建腺病毒载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-βNGF，为βNGF的基因功能及后期对脑外伤的基因移植治疗做好实验基础。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-7
缩略语  7-9
第一章前言  9-10
第二章材料与方法  10-19
  2.1 材料  10-12
  2.2 实验方法及步骤  12-19
第三章结果  19-23
  3.1 小鼠βNGF全长扩增片段  19-20
  3.2 pAdTrack-CMV-βNGF测序验证  20-21
  3.3 双酶切鉴定重组pAdTrack-CMV-βNGF质粒  21
  3.4 重组腺病毒表达载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-βNGF的酶切鉴定  21-23
第四章讨论  23-25
第五章结论  25-26
参考文献  26-28
综述  28-42
  参考文献  37-42
附录  42-44
致谢  44-45
个人简介  45

重组腺病毒载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-βNGF的构建和鉴定

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