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脉冲电场介导AT2R基因在血管局部表达及其对血管新生内膜影响

作 者: 刘德峰
导 师: 刘建平
学 校: 第三军医大学
专 业: 内科学
关键词: 电穿孔 血管紧张素Ⅱ型受体 基因转染 再狭窄 内膜损伤
分类号: R541.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


研究背景和目的:据世界卫生组织(World Health Organization WHO)统计,2010年,冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)所致死亡占总死亡人口的10%,位居第一[1]。随着经皮冠状动脉球囊成形术(PTCA)及经皮冠状动脉支架植入术(PCI)广泛应用于冠心病的治疗,使冠心病患者预后有了显著改善,死亡率明显降低,但PTCA及PCI术后有较高的再狭窄发生率[2,3],严重影响了PCI术的远期疗效,如何防治再狭窄成为冠心病介入治疗的重要课题之一。PTCA或PCI时,球囊损伤动脉内皮及中层,引起血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化、迁移、增殖及细胞外基质合成,形成新生内膜,而新生内膜的形成和增殖是引起支架内再狭窄的主要病理改变。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)受体主要有两型,即AngⅡ1型受体即AT1R和AngⅡ2型受体即AT2R。AngⅡ可通过AT1受体的激活发挥缩血管,促细胞增生迁移、促进新生内膜形成、细胞外基质沉积,促发炎症、血栓形成及氧化应激的效应,这些是再狭窄发生过程中主要因素之一。AT2受体激活则发挥舒张血管,抗增生抗血栓,诱导凋亡及产生一氧化氮NO的效应。因此我们选择血管紧张素Ⅱ2型受体基因(angⅡtype 2 receptor gene,AT2R gene)为靶点来观察其对再狭窄后新生内膜的影响。体内转基因(in vivo)是将目的基因直接导入病变部位细胞中,目的基因在原位表达而产生治疗效果。是最直接的基因治疗方法。但目前的困难主要是很难将目的基因送入血管局部并有效表达。现在常用基因载体介导基因转染,常用的基因载体有病毒类载体(如腺病毒载体、逆转录病毒载体)和非病毒类载体(如质粒载体、脂质体)载体,均距离理想的基因载体有一定的差距。腺病毒载体的毒性及免疫原性使其应用于临床受到限制。更有研究发现腺病毒载体对于动脉粥样硬化病灶的转染率低,而其他动脉被转染的危险增加。而且人群对病毒普遍具备免疫力,病毒载体易被宿主免疫系统清除致使基因表达时间短。非病毒类载体以质粒DNA为代表。它的主要优点是对携带基因的大小无限制,不易引起宿主细胞的免疫反应、不整合入宿主细胞DNA,缺点是转染效率低,特别是在活体组织局部转染时表达率更低。上世纪六七十年代,人们开始研究电穿孔法介导基因转染,细胞在电场的作用下可逆或者不可逆的出现细胞膜穿孔,这些孔道可以帮助基因分子进入细胞,大量研究证实[4,5],电穿孔法可增加基因的转染效果,并增加基因表达时间。但该方法多用于体外培养的细胞中,在活体组织中应用较少,而且查阅大量文献后活体血管电穿孔的研究比较少,本研究将电穿孔法用于活体血管组织中以达到增加AT2R在血管局部的过表达的目的,进而观察AT2R表达对大鼠血管损伤后新生内膜的影响作用。研究方法:1.以pUHD-10.3/AT2R质粒为模板,PCR扩增AT2R基因的全长cDNA序列,再将其克隆入载体pEGFP2-N2,构建其真核表达载体pEGFP-N2/AT2R。2.自制用于血管电穿孔的夹子状血管电极片及活体电穿孔仪器的准备。3.PTCA球囊损伤法构建再狭窄动物模型,通过脉冲电场介导pEGFP-AT2R或pEGFP-N2在大鼠颈总动脉内膜局部表达。4.免疫组织化学染色技术检测AT2R在大鼠颈总动脉内膜的表达5.RT-PCR技术检测AT2R mRNA在大鼠颈总动脉的表达6.HE染色检测AT2R表达对大鼠损伤后颈总动脉新生内膜的影响研究结果:1.pEGFP-N2/AT2R成功构建,经测序与基因库完全一致。2.自制夹子状电极片可用于电穿孔法介导重组AT2R真核表达质粒在体转染。3.PTCA球囊损伤法能成功构建再狭窄动物模型。4.免疫组化检测结果提示脉冲电场能有效介导AT2R在大鼠颈总动脉内膜表达,电穿孔转染组的颈总动脉内膜AT2R的表达水平显著高于单纯损伤组、空转组和不加电场转染组(P <0. 01),7d时仍维持较强表达,14d后迅速下降,21d时表达几乎消失。5.RT-PCR结果提示脉冲电场能有效介导AT2R在大鼠颈总动脉内膜表达,电穿孔转染组的颈总动脉内膜AT2R的表达水平显著高于对照组、空转组和不加电场转染组(P <0. 01),7d时仍维持较强表达,14d时达到高峰,之后迅速下降,21d时有微弱表达。6.HE染色结果提示:在转染21 d时,转染组的内膜面积与中膜面积比显著低于单纯损伤组和空转组[分别为(0.76±0.08)、(1.39±0.08)、(1.32±0.10),P<0.01],空转组和单纯损伤组之间无统计学差异(P>0.01)。研究结论;1. PTCA球囊损伤法能成功构建再狭窄动物模型,利用自制的血管电极可成功介导AT2R基因在大鼠颈总动脉血管壁内表达;2. AT2R基因在体转染可有效抑制球囊损伤后大鼠颈动脉内膜平滑肌细胞增殖、增生,从而抑制新生内膜增生。

全文目录


中英文缩写词一览表  4-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-12
前言  12-14
第一部分 脉冲电场介导AT2R 基因在大鼠血管局部的表达  14-40
  材料和方法  14-29
  结果  29-31
  讨论  31-33
  图片  33-40
第二部分 电穿孔法介导AT2R 在损伤血管局部表达对血管新生内膜的影响  40-54
  材料与方法  40-43
  结果  43-45
  讨论  45-47
  图片  47-54
全文总结  54-55
致谢  55-56
参考文献  56-59
文献综述 血管紧张素Ⅱ2 型受体介导的血管效应的研究进展  59-65
  参考文献  62-65
研究生期间发表的论文目录  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管(循环系)疾病 > 心脏疾病 > 冠状动脉(粥样)硬化性心脏病(冠心病)
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