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中国糯大麦种质资源及Wx基因的遗传多样性研究

作　者: 朱彩梅
导　师: 张京
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物种质资源学
关键词: 糯大麦直链淀粉含量 waxy基因遗传多样性
分类号: S512.3
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

糯大麦是指籽粒胚乳中直链淀粉含量很低或者为零的大麦。Waxy基因(简写为Wx)是控制大麦籽粒直链淀粉合成的关键基因,位于大麦7H染色体的短臂上,其编码酶蛋白的功能和特性直接影响大麦胚乳的淀粉结构、组成和加工品质。目前我国尚未对保存的大麦种质资源进行糯性鉴定及相关研究。开展糯大麦种质资源鉴定,研究我国糯大麦及其Wx基因的遗传多样性,不仅可以发现新的糯大麦种质,挖掘新的糯性淀粉等位基因,从而在亲本材料和糯性淀粉功能基因方面为我国大麦品质育种奠定基础,而且可以深入了解我国糯大麦品种的形成、衍化、分布和传播,以及Wx基因的等位变异类型、特点和分布及功能特点等,为栽培大麦的进化研究积累知识。本研究以我国作物种质资源库中保存的7700多份国内农家大麦品种为基础材料,采用半籽粒碘-碘化钾染色法进行表型鉴定,筛选出含糯性基因型的大麦品种,分析了它们的地理分布,讨论了糯大麦品种的形成;采用近红外法,分单株测定了这些品种的直链淀粉含量;通过SDS-PAGE电泳,对不同直链淀粉含量大麦品种的Wx蛋白进行了检测;采用SSR分子标记,对筛选的含糯性基因型的大麦品种进行了遗传多样性分析;根据公布的大麦Wx基因序列,利用Primer primer 5软件,在该基因的各个不同区域设计重叠引物,以2个国外糯大麦品种为对照,对30份高、中、低不同直链淀粉含量的中国大麦进行了Wx基因的PCR扩增、克隆、测序和等位变异分析。取得的主要研究结果如下:1.从7713份国内大麦种质资源中筛选出252份含糯性基因型的大麦品种,占鉴定品种总数的3.3%。不同品种糯性基因型个体所占比例差异很大,变异幅度为2.7%～90.0%,平均为32.8%。中国的糯大麦品种主要分布在黄河中下游、长江中下游、云贵及青藏高原地区,分别以河南、江苏和滇藏为中心。3个分布区之间,没有出现糯性基因频率从一个地区向另一个地区扩散传播的明显梯度变化,具有独立的突变起源。从糯大麦品种所占比例及其纯合程度来看,河南似乎是我国最早出现糯性基因突变和糯大麦品种的地区。糯大麦品种是糯性突变体在保持原有的分蘖力和不降低产量的情况下,由于籽粒变小、每穗粒数增加、提高了繁殖系数、逐代扩大其在群体中的比例而形成的。2.利用近红外反射光谱(NIRS)法,对含糯性基因型品种的直链淀粉含量测定结果表明,在中国大麦中鉴定发现的糯大麦种质均属低直糯大麦,尚无一份是无直糯大麦材料。162份含糯性基因型品种的直链淀粉含量变异范围为13.34～38.23%,平均值为25.23%,标准差为4.18,变异系数为16.56%。在28个品种中检测到直链淀粉含量小于15%的单株,其中在6个品种中鉴定出7份单株材料,其直链淀粉含量低于10%,可以在我国糯大麦育种和遗传等基础理论研究中优先利用,分别是鉴24(ZDM09222)、钜野米大麦(ZDM08677)、米大麦(ZDM00478)、芒大麦(ZDM00693)、三月黄大麦(ZDM09028)、光芒黄大麦(ZDM09113)。由于大麦品种间和品种内单株之间的直链淀粉含量存在很大差异,因此进行糯大麦种质资源鉴定筛选时,应在品种群体测定的基础上,进一步开展单株纯系繁殖鉴定;在杂交育种中选择糯大麦亲本时,不但要考虑备选品种的直链淀粉含量,还要考虑其个体基因型的遗传一致性。3.在低直糯大麦和无直糯大麦两种类型中,可能存在四种生化遗传变异类型。其中有两种与无直糯大麦有关,一种是Wx基因可以正常转录,但转录产生的Wx蛋白无活性,不能催化直链淀粉合成;另一种是Wx基因不能正常转录,既无Wx蛋白产生,也无直链淀粉合成。另外两种与低直糯大麦有关,一种是Wx基因可以正常转录,但转录产生的Wx蛋白活性有限,催化直链淀粉合成的功能降低;另一种是Wx基因不完全正常转录,产生的Wx蛋白数量有限,影响直链淀粉合成。4.利用50对SSR分子标记对162份含糯性基因型的中国大麦品种进行遗传多样性分析,在所有检测位点中,有效等位基因数为188.51,平均有效等位基因数为3.77,占总等位基因数的92.86%。表明中国糯大麦具有较高的遗传多样性,是进行大麦遗传改良的丰富基因库。对河南、江苏、云南和西藏的含糯性基因型大麦品种进行的SSR分析发现,其多态性信息指数、遗传多样性指数差别不大,进一步为中国不同地区的糯大麦基因可能起源于独立的自然突变提供了佐证。5.迄今利用Wx基因的STS引物P1,在大麦中共扩增出600bp、800bp和1000bp及800bp与1000bp杂合等4种带型。本研究在162个中国大麦品种的501个单株中,只检测到800bp、1000bp两种单一带型和这两条带同时出现的杂合带型,没有发现具有600bp带型的品种或单株,并且以1000bp的带型居多,杂合带型非常罕见,3种基因型分别占14.4%、85.2%和0.04%。6.在对32个大麦品种的核苷酸序列多态性鉴定中,共检测到了169个多态性位点,平均每26个bp检测到一个多态性位点。在所有检测到的多态性位点中,包括143个SNP和26个InDel,二者的频率分别为1/310和1/169。Wx基因的内含子1、3、5、8区,外显子2、5和5′-UTR及3′-UTR区域为变异富集区,其它区域变异较小。同时,Wx基因表现出连锁不平衡现象,外显子2和内含子1区域所承受的选择压力较小。7.中国6份低直链淀粉含量的大麦材料,均在其Wx基因前导序列区第637碱基处插入了5bp、757碱基处插入了4bp、891碱基处插入了4bp的片段。此外,还在这些低直链淀粉材料Wx基因的5′-UTR以及编码区,发现均有大量SNP出现,其中在编码区有11处是非同义突变。在23份中、高直链淀粉含量材料Wx基因的第1654碱基处,同时发现有15bp的碱基插入片段,但在6份低直链淀粉含量的材料中均没有出现该15bp的插入片段,表明中国低直链淀粉大麦材料存在共同的等位变异特征,与中高直淀粉含量材料相比,其直链淀粉含量降低可能与该片段的缺失有关。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章绪论  15-33
  1.1 糯大麦及其相关研究进展  15-28
    1.1.1 糯大麦研究概况  15-17
    1.1.2 糯大麦的鉴定方法和技术  17-18
    1.1.3 淀粉的结构和性质  18-21
    1.1.4 淀粉的生物合成及其相关合成酶  21-23
    1.1.5 Wx 基因和直链淀粉合成  23-26
    1.1.6 Wx 基因的表达及其结构变异  26-28
  1.2 糯大麦的遗传多样性研究  28-31
    1.2.1 遗传多样性的概念及研究方法  28
    1.2.2 分子标记在遗传多样性研究中的应用  28-29
    1.2.3 大麦Wx 位点等位基因多样性  29-30
    1.2.4 基因的核苷酸多态性与连锁不平衡  30-31
  1.3 立题意义和研究的技术路线  31-33
    1.3.1 立题意义  31-32
    1.3.2 技术路线  32-33
第二章中国糯大麦种质资源及其地理分布分析  33-44
  2.1 前言  33
  2.2 材料与方法  33-34
    2.2.1 材料  33
    2.2.2 取样与染色  33-34
    2.2.3 数据整理  34
  2.3 结果与分析  34-42
    2.3.1 糯大麦品种的比例  34-35
    2.3.2 不同类型大麦品种农艺性状  35-36
    2.3.3 品种内的糯性基因型频率  36-41
    2.3.4 糯大麦品种的地理分布  41-42
  2.4 讨论  42-44
    2.4.1 糯大麦品种的形成  42-43
    2.4.2 中国糯大麦的地理分布与起源  43
    2.4.3 中国糯大麦品种的国外传播  43-44
第三章中国糯大麦种质资源直链淀粉含量及WX 蛋白分析  44-61
  3.1 前言  44
  3.2 材料与方法  44-48
    3.2.1 实验材料  44-45
    3.2.2 直链淀粉含量测定  45-47
    3.2.3 Wx 蛋白提取与鉴定  47
    3.2.4 数据处理  47-48
  3.3 结果与分析  48-58
    3.3.1 不同品种间的淀粉含量差异  48-56
    3.3.2 品种内及单株间直链淀粉含量差异  56-57
    3.3.3 不同直链淀粉含量类型材料的Wx 蛋白分析  57-58
  3.4 讨论  58-61
    3.4.1 糯性基因型大麦品种的直链淀粉含量  58-59
    3.4.2 大麦Wx 蛋白电泳检测  59-61
第四章中国糯大麦种质资源遗传多样性分析  61-75
  4.1 前言  61
  4.2 材料与方法  61-69
    4.2.1 实验材料  61-65
    4.2.2 基因组DNA 的提取、纯化和鉴定  65-67
    4.2.3 SSR 分子标记分析  67-68
    4.2.4 数据统计分析  68-69
  4.3 结果与分析  69-73
    4.3.1 SSR 标记分析  69-71
    4.3.2 Shannon 指数及品种间的遗传差异比较  71
    4.3.3 基于SSR 分析的聚类结果  71-73
    4.3.4 不同地区糯大麦群体间的遗传多样性  73
  4.4 讨论  73-75
第五章中国糯大麦种质资源WX 基因的遗传多样性分析  75-96
  5.1 前言  75
  5.2 材料与方法  75-82
    5.2.1 实验材料  75-77
    5.2.2 基因组DNA 的提取、纯化和鉴定  77
    5.2.2 引物的选取与设计  77-79
    5.2.3 PCR 反应体系及扩增条件  79-80
    5.2.4 PCR 扩增产物的检测  80
    5.2.5 PCR 产物的回收、纯化与测序  80-81
    5.2.6 序列多态性统计分析  81-82
  5.3 结果与分析  82-92
    5.3.1 引物P1 的扩增结果  82-84
    5.3.2 引物P2、P3、P4 的扩增结果  84
    5.3.3 引物P5 与P6 的扩增结果  84-85
    5.3.4 Wx 基因序列多态性  85-88
    5.3.5 Wx 基因序列多样性位点分布分析  88-89
    5.3.6 Wx 基因编码区多态性分析  89-91
    5.3.7 Wx 等位基因连锁不平衡分析  91
    5.3.8 Wx 基因系统发育树分析  91-92
  5.4 讨论  92-96
    5.4.1 大麦Wx 基因的有效分子标记  92-94
    5.4.2 中国含糯性基因型大麦材料的Wx 基因类型  94
    5.4.3 Wx 基因序列多态性变异与直链淀粉含量（AC）  94-96
第六章全文结论  96-99
  6.1 中国糯大麦种质资源的表现形式  96
  6.2 中国糯大麦种质资源的地理分布、起源及形成  96
  6.3 中国糯大麦种质资源类型及品种间与品种内直链淀粉含量变异  96-97
  6.4 中国糯大麦种质资源的生化遗传变异类型  97
  6.5 中国糯大麦种质资源的遗传多样性  97
  6.6 中国糯大麦种质资源Wx 基因的等位变异  97
  6.7 Wx 基因等位变异与直链淀粉含量的相关性  97-98
  6.8 中国糯大麦与国外糯大麦品种之间的关系  98-99
参考文献  99-110
致谢  110-112
作者简历  112

中国糯大麦种质资源及Wx基因的遗传多样性研究

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