学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白T细胞表位区的研究

作　者: 王群
导　师: 吴东来
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽流感病毒 核蛋白 细胞免疫 T细胞表位
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 298次
引　用: 3次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


禽流感(avian influenza, AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类传染性疾病,高致病性禽流感病毒(high pathogenic avian influenza virus, HPAIV)在禽群(尤其是家禽)中可引起急性发病,甚至大量死亡,给养殖业造成巨大的损失。自1997年发生H5N1亚型禽流感病毒跨越种间屏障传染人以来,该病毒的相关研究备受关注并深入展开。目前,禽流感疫苗设计的焦点主要是能诱导产生中和抗体的病毒表面抗原血凝素(hemagglutinin, HA)和神经酸酶(neuraminidase, NA),而对其内部蛋白尤其是核蛋白(nucleoprotein, NP)相关的细胞免疫研究相对较少。本研究以禽痘病毒( fowlpox virus, FPV )表达系统为基础,将H5N1 AIV A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) (GD1/96)株NP全长分节段克隆至该系统,探寻其中是否存在T细胞表位。采用不同的引物对将NP全长分成6个截短片断,每个片段为140个氨基酸左右的肽段,各片断前后重叠70个氨基酸,PCR扩增后分别克隆至载体pSY538,同时在目的基因表达框下游引入LacZ表达盒便于后续重组毒筛选,然后将目的基因及LacZ表达元件整体酶切后连入禽痘病毒表达载体pSY638,最终获得重组质粒pSY-NPn-LacZ (n=1, 2, 3, 4, 5, 6)。将所获得的6个重组质粒分别转染预先感染过禽痘病毒S-FPV-017株的原代CEF,3-5d后待细胞出现80-100%细胞病变(CPE)时收获细胞及上清,冻融3次后采用噬斑纯化法通过蓝斑筛选获得并纯化含有NP各片段的重组痘病毒,随后在CEF上滴定各重组痘病毒滴度。结果表明成功获得片断1,3,4,5的重组禽痘病毒,分别命名为rFPV-NP1,rFPV-NP3,rFPV-NP4和rFPV-NP5,且其滴度均在2×10~6 pfu/mL左右。为了能在体内诱导SPF鸡产生针对AIV NP的记忆性T细胞,本研究将NP基因从重组质粒pVAX-NP上酶切后亚克隆至含禽源启动子的真核表达载体pCAGGS中,经筛选鉴定后获得重组子pCAGGS-NP。鉴定正确的阳性重组子体外转染真核细胞后,利用间接免疫荧光检测目的基因的瞬时表达状况;确定该重组质粒能正确表达NP后,将其以100μg/羽的剂量腿部肌肉注射免疫SPF鸡,同时设立空载体及空白免疫对照组,在二免三周后使用AIV A/Chicken/Heilongjiang/35/00(H9N2)弱毒株进行加强,利用ELISA检测免疫后血清抗NP蛋白抗体效价,检测结果表明,该重组质粒能在SPF鸡体内诱导产生针对AIV NP的抗体,抗体效价在加强免疫和弱毒感染后迅速提高,根据DNA疫苗诱导机体产生的免疫效应的原则可知免疫鸡体内同样产生了相关的细胞免疫反应。为了给各NP片段在活化的鸡淋巴细胞中诱导所产生的T细胞反应提供一种确实有效的检测评价方法,本研究经RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ-干扰素(Chicken interferon-γ,ChIFN-γ)和鸡的28S rRNA(Ch28S)的基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28S的RNA。然后将体外转录的ChIFN-γ和Ch28S RNA测定浓度后按10倍梯度稀释制作标准品,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28S RNA作为内参进行一步法实时定量RT-PCR检测ChIFN-γ。结果显示,ChIFN-γ和内参Ch28S的Ct值与标准品稀释梯度在1×10~2-1×10~7 copies/μL之间分别呈现出良好的线性关系,R2均大于0.99。建立了准确评价ChIFN-γ表达水平的实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)方法。待加强免疫的SPF鸡感染禽流感弱毒株4天后,将其各组SPF鸡处死并采集脾脏,分离脾淋巴细胞,分别采用一定剂量的rFPV-NP1、rFPV-NP3、rFPV-NP4和rFPV-NP5进行体外刺激培养。18h后分别收集培养上清和细胞,采用ELISA试剂盒检测培养上清中ChIFN-γ分泌量,一部分细胞用于荧光定量RT-PCR检测ChIFN-γ基因转录状况,另一部分细胞采用流式细胞术对刺激培养后细胞中CD8+T细胞增殖情况进行检测,检测结果一致显示rFPV-NP5能刺激NP活化的鸡淋巴细胞IFN-γ基因转录水平提高、ChIFN-γ分泌量明显增加,CD8+T细胞含量显著提高。表明在AIV GD1/96 NP的第5片断即NP277-421能诱导产生较强的细胞免疫反应,可能存在T细胞表位。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章 绪论  15-30
  1.1 流感病毒  15-22
    1.1.1 流感病毒的历史  15-16
    1.1.2 流感病毒的分类  16
    1.1.3 A 型流感病毒的结构  16-17
    1.1.4 A 型流感病毒的基因组成  17-21
    1.1.5 高致病性禽流感病毒  21-22
  1.2 T 细胞表位的研究方法  22-27
    1.2.1 表位预测  23
    1.2.2 有限稀释法  23-24
    1.2.3 ~(51)Cr释放试验  24
    1.2.4 MHC 四聚体技术  24-25
    1.2.5 胞内细胞因子染色  25
    1.2.6 酶联免疫斑点法  25-26
    1.2.7 荧光测定法  26-27
  1.3 流感病毒T 细胞表位的研究进展  27-28
  1.4 研究目的和意义  28-30
第二章 鸡Γ-干扰素的实时定量 RT-PCR 检测方法的建立  30-43
  2.1 实验材料  31-34
    2.1.1 实验动物  31
    2.1.2 质粒和菌种  31
    2.1.3 主要试剂  31
    2.1.4 主要溶液和培养基的配置  31-33
    2.1.5 主要仪器  33-34
  2.2 试验方法  34-37
    2.2.1 引物设计  34
    2.2.2 鸡脾淋巴细胞的分离培养和总RNA 的提取  34-35
    2.2.3 ChIFN-γ和Ch28S 基因的扩增  35
    2.2.4 所扩增ChIFN-γ基因的进化分析  35
    2.2.5 重组体外转录载体的构建与鉴定  35
    2.2.6 体外转录模板的制备  35-36
    2.2.7 ChIFN-γ基因和Ch28S 基因的体外转录  36
    2.2.8 转录产物的纯化  36
    2.2.9 转录产物的鉴定及定量  36
    2.2.10 标准曲线的绘制  36-37
  2.3 结果  37-41
    2.3.1 ChIFN-γ和Ch28S Real-time RT-PCR 引物和探针的设计  37-38
    2.3.2 ChIFN-γ基因和Ch28S 基因的扩增  38
    2.3.3 ChIFN-γ基因序列分析  38
    2.3.4 重组体外转录载体的构建与鉴定  38
    2.3.5 体外转录模板的鉴定  38
    2.3.6 目的基因体外转录的鉴定及转录产物的定量  38-41
    2.3.7 标准曲线的绘制  41
  2.4 讨论  41-43
第三章 含禽源启动子的禽流感病毒核蛋白表达载体的构建  43-55
  3.1 实验材料  44-46
    3.1.1 实验动物与鸡胚  44
    3.1.2 质粒与菌种  44
    3.1.3 细胞系  44
    3.1.4 工具酶与试剂  44
    3.1.5 主要溶液和培养基的配置  44-46
    3.1.6 主要仪器  46
  3.2 实验方法  46-49
    3.2.1 引物设计  46
    3.2.2 真核表达质粒pCAGGS-NP 的构建  46-47
    3.2.3 鸡胚成纤维细胞的制备  47
    3.2.4 重组质粒转染鸡胚成纤维细胞  47
    3.2.5 间接免疫荧光检测NP 蛋白的瞬时表达  47-48
    3.2.6 Western-blot 检测NP 蛋白的瞬时表达  48
    3.2.7 ELISA 检测方法的建立  48
    3.2.8 免疫用质粒的制备  48-49
    3.2.9 免疫与抗体检测  49
  3.3 结果  49-53
    3.3.1 真核表达质粒pCAGGS-NP 的构建  49-50
    3.3.2 间接免疫荧光（IFA）检测pCAGGS-NP 瞬时表达  50
    3.3.3 Western-blot 检测pCAGG-NP 瞬时表达  50-52
    3.3.4 ELISA 检测方法反应条件的确定  52
    3.3.5 血清中NP 抗体的ELISA 检测  52-53
  3.4 讨论  53-55
第四章 H5N1 禽流感病毒核蛋白分节段重组痘病毒的构建  55-67
  4.1 实验材料  56-57
    4.1.1 质粒菌种  56
    4.1.2 病毒  56
    4.1.3 细胞  56
    4.1.4 工具酶与试剂  56-57
    4.1.5 主要溶液和培养基的配置  57
  4.2 实验方法  57-61
    4.2.1 引物设计  57-58
    4.2.2 鸡胚成纤维细胞的制备  58
    4.2.3 分节段NP 重组禽痘病毒转移载体的构建  58
    4.2.4 转染质粒的提取  58-60
    4.2.5 痘病毒储存样品的准备  60
    4.2.6 转染  60
    4.2.7 重组禽痘病毒的筛选及纯化  60
    4.2.8 重组禽痘病毒的PCR 鉴定  60-61
    4.2.9 重组禽痘病毒蛋白表达的检测  61
  4.3 结果  61-64
    4.3.1 分节段NP 重组禽痘病毒转移载体的构建  61
    4.3.2 分节段NP 重组禽痘病毒的构建  61-64
    4.3.3 重组禽痘病毒的PCR 鉴定  64
    4.3.4 重组禽痘病毒的SDS-PAGE 鉴定  64
  4.4 讨论  64-67
第五章 禽流感病毒核蛋白截短表达重组禽痘病毒相关细胞免疫活性的检测  67-77
  5.1 实验材料  68-69
    5.1.1 细胞  68
    5.1.2 病毒  68
    5.1.3 试剂  68
    5.1.4 主要溶液和培养基的配置  68-69
  5.2 实验方法  69-72
    5.2.1 病毒的定量  69-70
    5.2.2 DNA 疫苗免疫鸡淋巴细胞的制备及体外刺激  70
    5.2.3 刺激后即脾淋巴细胞RNA 的制备及ChIFN-γmRNA 检测  70-71
    5.2.4 刺激后细胞上清中ChIFN-γ的检测  71
    5.2.5 刺激后CD8~+ T细胞的增殖  71-72
  5.3 实验结果  72-74
    5.3.1 病毒的定量  72-73
    5.3.2 细胞RNA 中ChIFN-γ转录情况的检测  73
    5.3.3 细胞上清中ChIFN-γ表达情况的检测  73
    5.3.4 CD8~+ T细胞的增殖  73-74
  5.4 讨论  74-77
第六章 全文结论  77-78
参考文献  78-97
致谢  97-98
作者简介  98-99

相似论文

  1. 数字电路内建自测试方法的研究,TN79
  2. 河南低致病性禽流感病毒（H9亚型）分离鉴定及生物学特性研究,S852.65
  3. H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其AC-ELISA检测方法的建立,S855.3
  4. 我国11株H5N2亚型AIV的基因特征及对禽的致病性研究,S852.65
  5. 人参皂苷Rg1对优化培养的人脐血MSCs增殖、分泌功能与ERK、p38信号分子的影响,R285.5
  6. T细胞免疫及相关心理社会因素与儿童抽动障碍关系的研究,R749.94
  7. EpCAMhigh/CD44+标记的大肠癌干细胞与β-catenin在大肠癌中的表达及临床意义,R735.34
  8. cathepsinB在剥脱综合征性白内障晶状体上皮细胞中的表达与相关性研究,R776.1
  9. 自体CIK细胞过继免疫治疗恶性实体瘤的临床研究,R730.5
  10. 神经突触核蛋白-γ（SNCG）对肝癌细胞抗微管药物作用效果的影响及其相关机制初探,R735.7
  11. DC-CIK细胞抗白血病细胞K562的免疫效应机制研究,R733.7
  12. 海藻糖对alpha突触核蛋白聚集的影响,R742.5
  13. 刚地弓形虫HSP70基因重组质粒的构建及其诱导小鼠的细胞免疫应答,R38
  14. 四川骨髓库汉族人群KIR基因多态性研究,R394
  15. 免疫球蛋白G在成年大鼠肝脏细胞中的表达,R392
  16. FTH1在B.ovis 019株侵染小鼠巨噬细胞中的功能研究,S852.61
  17. 狂犬病病毒CVS株N基因的原核表达、纯化及鉴定,S852.65
  18. 口蹄疫A型病毒AF/72株主要B细胞表位的筛选鉴定,S852.65
  19. 禽流感病毒M2e基因多拷贝串联体的原核表达及免疫原性研究,S852.65
  20. 酵母双杂交筛选禽流感病毒PA相互作用蛋白的研究,S852.65
  21. 镉污染环境修复工程菌的构建及其初步应用,X172

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
© 2012 www.xueweilunwen.com