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中国对虾血细胞发生、功能及其白斑综合征病毒受体蛋白研究

作　者: 林颖博
导　师: 战文斌
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水生生物学
关键词: 中国对虾血细胞发生血细胞吞噬 WSSV 受体抗体
分类号: S945.46
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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引　用: 3次
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内容摘要

本论文在研制的抗中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞单克隆抗体的基础上,通过间接免疫荧光技术首次检测到中国对虾血细胞最早出现于肢芽期,大颗粒细胞最早出现于膜内无节幼体期;通过流式细胞技术研究发现,中国对虾血细胞对荧光微球的吞噬率在注射后迅速升高并在6h后达到最高值,被吞噬的荧光微球在淋巴器官中积累,血细胞吞噬率在白斑综合征病毒(WSSV)感染后虽在短时间内升高但随后迅速降低;论文建立了差速离心法提取的中国对虾血细胞膜与地高辛标记WSSV的Dot-Blot和ELISA体外结合体系作为筛选体系,从制备的中国对虾血细胞膜单克隆抗体中筛选到一株对WSSV具有阻断作用的单克隆抗体R2H1,为进一步研究WSSV与宿主的相互作用机理提供了基础。(1)利用杂交瘤技术,论文制备了特异性识别中国对虾所有三类血细胞的单抗2A3和特异性识别中国对虾大颗粒血细胞中细胞质颗粒的单抗1H11。通过对包括囊胚期、原肠胚期、肢芽期、膜内无节幼体期和无节幼体Ⅰ期在内的中国对虾胚胎的间接免疫荧光检测,最早在肢芽期胚胎中检测到2A3阳性信号;在膜内无节幼体期,2A3阳性血细胞平均直径约7μm,聚集成簇;在无节幼体Ⅰ期,血细胞形态更加完整清晰,平均直径已与成体对虾血细胞相似。1H11阳性大颗粒细胞最早在膜内无节幼体期胚胎中出现,这些细胞同样成簇存在,在其细胞质外围可见点状荧光。在无节幼体Ⅰ期样品中,血细胞总数和大颗粒细胞数量较胚胎期都显著增加,反映了对虾免疫系统随着胚胎发育的进行而加强。(2)流式细胞术分析显示,健康中国对虾血细胞对注射入体内的荧光微球的吞噬在注射后迅速升高并在6h后达到最高点12.58%;随后该比率逐渐下降,至注射后16h实验结束时,血细胞吞噬率已下降到4.02%,反映了血细胞对血淋巴中异物的清除过程。显微镜观察注射微球6h后中国对虾的外周血细胞和淋巴器官,发现主要是半颗粒细胞执行对微球的吞噬,吞噬后的荧光微球在淋巴器官中积累。WSSV感染后第一天,血细胞吞噬率(14.42%)由于应激作用而略高于对照值;随后,该比率迅速降低并维持在对照值的50%左右(6.12%);在感染后第六天,血细胞吞噬率再次上升至11.23%,随后感染对虾大量死亡。(3)论文通过差速离心法提取海捕中国对虾血细胞膜,分别利用Dot-Blot和ELISA技术,使地高辛(DIG)标记的WSSV与之4°C结合4h并以抗DIG抗体作为探针检测,实验结果皆为阳性,证明体外环境下WSSV能稳定地与血细胞膜结合。以抗中国对虾血细胞膜多克隆抗体37°C孵育血细胞膜1h,能够阻断WSSV-DIG与血细胞膜的结合,证明该体外结合体系可以应用于WSSV阻断剂的筛选。应用ELISA体外结合技术,从制备的中国对虾血细胞膜单克隆抗体中筛选具有阻断效果的阳性孔,克隆获得一株单抗R2H1可以显著(P<0.05)削弱WSSV与对虾血细胞膜的体外结合。以Dot-Blot验证,R2H1阻断组发色明显浅于未阻断组。可以推断,R2H1与中国对虾血细胞膜上的受体蛋白结合,从而抑制了WSSV与血细胞膜的体外结合。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章文献综述  11-37
  1.1 甲壳动物血细胞  11-15
  1.2 甲克动物血细胞的免疫防御功能  15-25
  1.3 对虾白斑综合征及对虾白斑综合征病毒  25-37
第二章中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞的胚胎发生  37-55
  2.1 研究背景  37
  2.2 材料与方法  37-45
    2.2.1 中国对虾血细胞提取及血滴片制作  37-38
    2.2.2 抗中国对虾血细胞单克隆抗体的生产  38-41
    2.2.3 中国对虾各期胚胎和幼体的取样及固定  41-42
    2.2.4 石蜡切片及 H&E 染色  42-44
    2.2.5 中国对虾胚胎冰冻切片及免疫荧光检测  44-45
  2.3 实验结果  45-52
    2.3.1 抗中国对虾血细胞单克隆抗体生产及特性鉴定  45-48
    2.3.2 中国对虾胚胎取样及 H&E 染色  48-49
    2.3.3 中国对虾血细胞的胚胎发生  49-51
    2.3.4 中国对虾大颗粒血细胞的出现  51-52
  2.4 讨论  52-55
第三章中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞吞噬功能的研究  55-65
  3.1 研究背景  55
  3.2 材料和方法  55-59
    3.2.1 中国对虾血细胞对荧光微球的体内吞噬  55-56
    3.2.2 中国对虾的人工投喂感染  56-57
    3.2.3 WSSV 感染的间接免疫荧光检测  57
    3.2.4 WSSV 感染的 PCR 检测  57-59
    3.2.5 WSSV 感染对中国对虾血细胞吞噬功能的影响  59
  3.3 实验结果  59-63
    3.3.1 中国对虾血细胞对荧光微球的吞噬  59-61
    3.3.2 间接免疫荧光和 PCR 证明中国对虾被 WSSV 成功感染  61-62
    3.3.3 WSSV 感染对中国对虾血细胞吞噬功能的影响  62-63
  3.4 讨论  63-65
第四章白斑症病毒(WSSV)的中国对虾血细胞膜受体抗体的筛选  65-81
  4.1 研究背景  65
  4.2 材料与方法  65-72
    4.2.1 白斑症病毒(WSSV)颗粒的提纯  65-66
    4.2.2 WSSV 颗粒的地高辛(DIG)标记  66-68
    4.2.3 中国对虾血细胞膜的粗提  68-69
    4.2.4 WSSV 与中国对虾血细胞膜的 ELISA 体外结合  69-70
    4.2.5 WSSV 与中国对虾血细胞膜的 Dot-Blot 体外结合  70
    4.2.6 抗中国对虾血细胞膜多克隆抗体的制备  70-71
    4.2.7 抗中国对虾血细胞膜多抗阻断 WSSV 与血细胞膜的结合  71
    3.2.8 WSSV 中国对虾血细胞膜受体单克隆抗体的筛选  71-72
  4.3 实验结果  72-77
    4.3.1 中国对虾血细胞膜的提取  72-73
    4.3.2 WSSV 的提纯及 DIG 标记  73-74
    4.3.3 抗中国对虾血细胞多克隆抗体制备  74
    4.3.4 ELISA 法检测 WSSV 与血细胞膜的体外结合及其多抗阻断  74-75
    4.3.5 Dot-Blot 法检测 WSSV 与血细胞膜的体外结合及其多抗阻断  75-76
    4.3.6 WSSV 中国对虾血细胞膜受体抗体的筛选  76-77
  4.4 讨论  77-81
参考文献  81-93
致谢  93-94
个人简历  94
发表的学术论文  94

中国对虾血细胞发生、功能及其白斑综合征病毒受体蛋白研究

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