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食源性肥胖大鼠和肥胖抵抗大鼠下丘脑的蛋白组学研究

作　者: 蔡滢
导　师: 田德润；王启明
学　校: 天津医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 食源性肥胖肥胖抵抗下丘脑蛋白质组学 2D-DIGE 质谱
分类号: R589.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着人们生活水平的提高,肥胖人口在全球范围内不断增多,肥胖诱发的相关疾病也日趋严重,威胁着人类的健康,加重了社会负担。肥胖的产生主要是由于摄入的热量过多,在体内形成脂肪堆积造成的。在维持机体能量平衡的过程中,下丘脑发挥了关键的作用。前期研究发现,下丘脑能够释放具有刺激或抑制摄食作用的神经多肽,如神经肽Y (NPY)和a-黑色素细胞刺激促激素(a-MSH)等,通过调控摄食行为维持机体能量平衡。随着研究的深入,不断有新的信号蛋白被发现对肥胖的产生发挥了重要作用,以往的理论已不能完全解释肥胖产生的原因。目的：本研究旨在通过对DIO和DR大鼠下丘脑的蛋白组学研究,筛选并鉴定下丘脑差异表达的蛋白质,揭示下丘脑内摄食相关蛋白质和神经肽在肥胖发展过程的作用,为肥胖的防治提供新的靶标。方法：1.建立DIO-DR大鼠模型。2.采用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)的技术筛选并鉴定DIO-DR大鼠下丘脑差异表达的蛋白质。3.进一步运用荧光差异双向电泳(two-dimensional differential in-gel eletrophoresis,2D-DIGE)结合串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)的技术筛选并鉴定DIO-DR大鼠下丘脑差异表达的蛋白质。4.利用免疫组化和western blotting的方法对DIO-DR大鼠下丘脑部分差异表达蛋白质(包括PDI、GSTM1、SNAP-25等)进行定位和定量的检测,并对其功能展开深入研究。结果：.DIO和DR大鼠表型差异：1.DIO大鼠与DR大鼠初始体重相当,给予高脂饮食后,DIO大鼠体重增长速度快于DR大鼠,每日平均摄食量多于DR大鼠。2.DIO大鼠腓肠肌、睾丸和心脏的重量与DR大鼠相当,而内脏脂肪含量如附睾、肾周脂肪重量明显高于DR大鼠。3.DIO大鼠的甘油三酯、自由脂肪酸水平高于DR大鼠,而DR大鼠与普通饲料对照组水平相当。4. Elisa检测发现在肥胖早期(4周)和中期(8周)DIO大鼠的血清瘦素、胰岛素水平与对照组和DR组相比没有明显差异；而在肥胖后期(14周)DIO大鼠血清瘦素、胰岛素水平明显高于DR组(p<0.05),DR大鼠水平与对照组无显著性差异,提示DIO大鼠长期高脂喂养后出现瘦素抵抗和胰岛素抵抗。二.2DE结合质谱技术对DIO-DR大鼠下丘脑进行差异表达蛋白质的筛选和鉴定：1.筛选并鉴定出22种蛋白质,其中7种在DIO组呈高表达,7种下调,6种在DR组高表达,6种下调。2.这22种蛋白质分别属于抗氧化蛋白(PRDX1, GSTM1)、细胞代谢相关蛋白(UCHL-1X)、细胞周期调控蛋白、细胞骨架蛋白及未知蛋白等不同类别。三.2D-DIGE结合串联质谱对DIO-DR大鼠下丘脑进行差异表达蛋白质的筛选和鉴定：1.运用2D-DIGE筛选出42个蛋白质点,运用串联质谱技术(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定出33种蛋白质,其中DIO组与对照组相比表达上调的有9个,下调的有2个；DIO组与DR组相比表达上调的有8个,下调的有9个；DR组与对照组相比上调的有8个,下调的有4个。2.将2D-DIGE结合串联质谱技术与2DE结合质谱技术进行比较发现,2D-DIGE所需样品量少,敏感性和特异性更高,筛选出更多的差异蛋白质点。而串联质谱技术也比一级质谱鉴定出更准确的蛋白质结构,得到更信服的结果。这33个蛋白质其中部分与2DE结合一级质谱的鉴定结果相一致,主要包括抗氧化蛋白、分子伴侣、细胞代谢相关蛋白、突触相关蛋白、细胞骨架蛋白等几个类别,其中抗氧化蛋白1(PRDX1X)、谷胱甘肽转移酶1(GSTM1X)、二硫键异构酶(PDI)、泛素C末端水解酶L1 (UCHL1)等可能与肥胖的发生有密切的联系,并发现了动力蛋白1(Dynamin 1)和SNAP-25等新的信号蛋白。四.免疫组化和western boltting方法对差异蛋白质进行定位和定量的研究1.免疫组化发现PDI、PRDX1和Dynamin1在DIO大鼠下丘脑阳性表达增强；SNAP-25在DIO大鼠下丘脑表达下调,在DR大鼠下丘脑表达上调。2. western blotting检测发现Dynamin1在DIO组表达上调,与对照组和DR组相比具有显著性差异；PDI、PRDXl和GSTM1在DIO组表达上调且在DR组表达下调(与对照组相比);UCHL-1和SNAP-25在DIO组表达下调且在DR组表达上调(与对照组相比)。结论：1.成功建立了DIO-DR大鼠模型,与人类肥胖具有很多相似的特征。2.通过蛋白质组学的研究,成功筛选和鉴定了DIO和DR大鼠下丘脑差异表达蛋白,而DIGE技术的应用,发掘了更多肥胖相关的信号分子,为深入研究肥胖的发病机制奠定了基础。3.DIO大鼠下丘脑由于长期高脂饮食发生细胞应激反应(氧化应激和内质网应激),干扰了瘦素和胰岛素的信号转导通路,造成DIO大鼠瘦素抵抗和胰岛素抵抗,并进而发展为肥胖。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-13
缩略语  13-16
前言  16-19
  研究现状、成果  16-18
  研究目的、方法  18-19
一、DIO-DR大鼠模型的建立  19-27
  前言  19
  1.1 对象和方法  19-20
    1.1.1 建立动物模型  19-20
    1.1.2 动物饲料  20
    1.1.3 大鼠下丘脑的提取  20
    1.1.4 Elisa测定大鼠瘦素、胰岛素含量  20
  1.2 结果  20-25
    1.2.1 高能饲养后大鼠体重的变化  20-22
    1.2.2 高能饲养后大鼠内脏重量的变化  22-23
    1.2.3 Elisa测定大鼠瘦素、胰岛素的含量  23-25
  1.3 讨论  25-26
  1.4 小结  26-27
二、2-DE结合质谱技术筛选差异表达蛋白质点及生物信息分析  27-42
  前言  27-28
  2.1 材料和方法  28-35
    2.1.1 大鼠下丘脑总蛋白的提取  28
    2.1.2 蛋白定量  28-29
    2.1.3 双向电泳  29-34
    2.1.4 图像分析  34
    2.1.5 胶内酶解  34
    2.1.6 质谱分析  34
    2.1.7 数据库检索  34-35
  2.2 结果  35-39
    2.2.1 Bradford法检测样本蛋白定量的结果  35
    2.2.2 下丘脑蛋白质组的2-DE差异分析  35
    2.2.3 差异蛋白质点的质谱鉴定及数据库检索  35-39
  2.3 讨论  39-41
  2.4 小结  41-42
三、2D-DIGE结合串联质谱筛选差异表达蛋白质点及生物信息分析  42-59
  前言  42
  3.1 材料和方法  42-48
    3.1.1 主要仪器  42
    3.1.2 主要试剂  42-43
    3.1.3 样品制备和蛋白定量  43-44
    3.1.4 荧光差异双向电泳  44-47
    3.1.5 固定与染色  47-48
    3.1.6 图像扫描  48
    3.1.7 图像分析  48
    3.1.8 质谱分析  48
  3.2 结果  48-57
    3.2.1 Bradford法检测样本定量结果  48-49
    3.2.2 下丘脑蛋白质组的2D-DIGE差异分析  49-53
    3.2.3 差异蛋白质点的MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定及数据库检索  53-57
  3.3 讨论  57-58
  3.4 小结  58-59
四、下丘脑差异表达蛋白与DIO、DR的相关性研究  59-82
  前言  59
  4.1 材料与方法  59-66
    4.1.1 Western Blotting检测下丘脑差异蛋白质的表达  59-62
    4.1.2 免疫组织化学研究  62-66
    4.1.3 实验数据处理和统计学分析  66
  4.2 结果  66-70
    4.2.1 Western Blotting检测下丘脑差异蛋白质的表达  66-67
    4.2.2 免疫组化方法检测下丘脑差异蛋白质的表达  67-70
  4.3 讨论  70-81
    4.3.1 下丘脑与瘦素、胰岛素的关系  70-71
    4.3.2 肥胖与氧化应激  71-74
    4.3.3 肥胖与内质网应激  74-76
    4.3.4 突触相关蛋白与肥胖的关系  76-77
    4.3.5 泛素蛋白酶体系统与肥胖  77-79
    4.3.6 其他差异表达蛋白质与肥胖之间的关系  79-81
  4.4 小结  81-82
全文结论  82-83
论文创新点  83-84
参考文献  84-96
发表论文和参加科研情况说明  96-97
综述肥胖与细胞应激  97-121
  综述参考文献  110-121
致谢  121

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