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电压门控式氯通道在鸡喙下颌早期发育中作用的研究

作　者: 田美玉
导　师: 段银钟；段小红
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: ClC型氯通道外胚间充质细胞软骨细胞鸡喙下颌骨 NPPB
分类号: R78
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

下颌骨的早期发育是一个复杂的过程,原始的未分化间充质细胞移行、凝聚、增殖,形成细胞凝聚区,由未分化间充质细胞分化为软骨细胞、骨细胞,合成并分泌软骨基质、骨基质,逐渐形成下颌骨的形态。整个过程受很多因素的调控,它们参与了下颌骨的早期发育。电压门控式氯通道在真核细胞广泛表达,参与调节细胞及细胞器的功能,在调节细胞内pH值、细胞代谢、细胞物质转运、细胞增殖、分化、凋亡及细胞容量稳定中起了重要的作用。在体外培养的兔关节软骨细胞中发现氯离子是决定细胞膜电位的主要因素。同时大量研究表明氯通道基因的突变会引起骨代谢异常,骨形态体积的改变。ClC-7突变引起人和鼠的骨硬化症。Clcn5基因敲除小鼠出现脊柱异常和牙齿生长异常。Clcn3基因敲除小鼠表现出生长发育受限且伴有脊柱异常。这些研究表明ClC型氯通道在骨的形成中起了重要的作用。在下颌骨发育的过程中,骨的形成是通过两种方式:即软骨内成骨和软骨膜内成骨。因此推测ClC型氯通道可能在下颌骨软骨形成阶段就起了重要的作用。ClC型氯通道在软骨分化中所起的作用及其机理尚不清楚。对于它们的研究有助于了解颌面部骨畸形的发生机理,并为颌骨发育异常的治疗提供新的思路。因此,为了探讨ClC型氯通道在颌骨发育过程中的作用及其机理,我们设计并进行了如下实验:1.不同发育阶段鸡喙下颌的组织学研究及ClC型氯通道的表达取不同发育阶段的鸡喙下颌组织,用HE及阿尔新兰染色的方法,观察鸡喙的组织学变化,并采用RT-PCR的方法检测氯通道CLC1-7mRNA在鸡喙下颌组织中的表达。观察不同发育阶段鸡喙的组织学变化以及氯通道在鸡喙组织中的表达。2.鸡喙下颌间充质细胞的生物学研究在解剖显微镜下取4.5天(26stage)鸡喙下颌组织,利用混合酶消化法分离鸡喙下颌间充质细胞(chicken mandibular mesenchymal cells,CMMC)。RT-PCR检测II型胶原和aggrecan、X型胶原、Sox9 mRNA在CMMC的表达。利用AA-BGP诱导CMMC增殖分化。采用MTT法检测AA-BGP诱导对CMMC增殖的影响。对CMMC进行微团培养,采用阿尔新兰染色检测AA-BGP诱导对其分泌基质的影响;采用real-time PCR法检测AA-BGP诱导对其分化过程中特异性标志物(Col2a1,aggrecan,Col10)及转录因子(Sox9)的影响。研究CMMC在AA-BGP诱导下它的生物学变化。3.氯通道阻断剂NPPB对鸡喙下颌间充质细胞作用的研究采用real-time PCR法检测NPPB对体外微团培养的CMMC中氯通道的阻断作用。以AA-BGP诱导组和未诱导组为研究对象,采用MTT法检测NPPB对CMMC增殖的影响。对CMMC进行微团培养,采用阿尔新兰染色检测NPPB对CMMC分泌基质的影响;采用real-time PCR法检测NPPB对CMMC分化过程中标志物基因的表达情况的影响。研究NPPB对CMMC增殖分化等作用的影响。结果发现:1. 4.5天时的鸡喙下颌组织中大多为未分化的间充质细胞,到8天时软骨细胞分化成熟,大量软骨出现。14天时,大量骨组织形成,鸡喙下颌发育已基本与成年鸡喙相似。17天时几乎全部为骨组织,仅有一小部分软骨终身不钙化。首次发现CLCN1和CLCN3-7 mRNA在鸡喙下颌组织中广泛表达,但表达强度不同。2. RT-PCR检测发现II型胶原和aggrecan、X型胶原、Sox9 mRNA在CMMC均有表达,其表达水平不同。AA-BGP对细胞干预后,MTT检测发现AA-BGP诱导CMMC增殖。Real-timePCR检测发现AA-BGP诱导CMMC分化:II型胶原、aggrecan(p<0.01)、Sox9 mRNA的表达增高(p<0.05),但X型胶原mRNA的表达未受影响(p>0.05)。阿尔新兰染色发现AA-BGP诱导软骨基质的分泌增多。3.在AA-BGP诱导组或无AA-BGP诱导组,MTT检测发现NPPB抑制了CMMC的增殖;阿尔新兰染色发现NPPB抑制了软骨基质的分泌。Real-time PCR检测发现NPPB阻断了氯离子CLCN3、CLCN5和CLCN7 mRNA的表达(p<0.05),对CLCN1、4、6 mRNA的表达的影响没有显著性差异(p>0.05)。NPPB对II型胶原和aggrecan、Sox9 mRNA的表达的影响没有显著性差异(p>0.05),但NPPB下调X型胶原mRNA的表达水平有显著性差异(p<0.05)。NPPB对抗AA-BGP诱导II型胶原和aggrecan mRNA的表达(p<0.05),但Sox9mRNA的表达不受影响(p>0.05)。结论:1.鸡喙下颌发育经历了从未分化的间充质细胞分化为软骨细胞,继而软骨膜内成骨,最终钙化成骨,并有一小部分软骨终生不钙化。CLC1和CLC3-7在鸡喙下颌组织中广泛表达。2.体外培养的CMMC,II型胶原、aggrecan、X型胶原、Sox9 mRNA均有表达,表达水平不同。在AA-BGP诱导下,CMMC增殖明显,同时分泌软骨基质增多,其作用机制可能是调节细胞内酸碱平衡影响CMMC的增殖及基质分泌。软骨分化早期的特异性标志物II型胶原、aggrecan mRNA的表达增高,而分化晚期的特异标志物X型胶原的表达未受影响。同时作为II型胶原、aggrecan mRNA调节基因的Sox9的表达也增高,结果提示AA-BGP对软骨分化的作用是通过或部分通过Sox9来调节的。3.体外培养的CMMC,NPPB抑制了CLCN3、CLCN5和CLCN7 mRNA的表达。NPPB抑制细胞的增殖和软骨基质的分泌,同时它对抗AA-BGP诱导的细胞增殖和分化(除外Sox9)。NPPB下调软骨分化特异性标志物X型胶原,而对II型胶原、aggrecan及Sox9无影响,结果提示CLCN3、CLCN5和CLCN7在鸡喙下颌发育早期软骨细胞分化为肥大化的软骨细胞过程前后起了重要的作用,其作用靶点是X型胶原,它的作用机制与转录因子Sox9无关。CLCN3、CLCN5和CLCN7作为细胞内重要的nCl?/H+交换体,其作用基质可能是调节细胞内酸碱平衡来影响细胞的增殖和分化等生物学功能。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-16
前言  16-18
文献回顾  18-37
  第一部分颌骨的发育及其调控机制  18-31
  第二部分氯通道的研究背景  31-37
正文  37-70
  实验一早期鸡喙组织学及ClC 型氯通道表达的研究  37-49
    1 材料  38-39
    2 方法  39-44
    3 结果  44-47
    4 讨论  47-49
  实验二鸡喙来源的间充质细胞生物学特性的研究  49-60
    1 材料  49-50
    2 方法  50-55
    3 结果  55-58
    4 讨论  58-60
  实验三 CLC 在鸡喙间充质细胞增殖分化中的作用研究  60-70
    1 材料  60-61
    2 方法  61-62
    3 结果  62-67
    4 讨论  67-70
小结  70-72
参考文献  72-86
个人简历和研究成果  86-87
致谢  87

电压门控式氯通道在鸡喙下颌早期发育中作用的研究

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