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东祁连山高寒草地土壤真菌多样性研究

作　者: 张俊忠
导　师: 陈秀蓉
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草地生物多样性
关键词: 东祁连山高寒草地土壤真菌多样性生态分布 DGGE ITS rDNA序列析生物学特性
分类号: S812.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

土壤微生物是草地农业生态系统的重要组成部分,在能量流动、物质循环以及土壤的形成与熟化过程中均起重要作用。同时也是反应环境变化的敏感指示生物,其种群数量和组成是评价草地土壤环境质量的重要参数。研究土壤微生物的数量、种群多样性、生态分布以及生理功能群对提高草地生态系统的生产力,使之持续稳定发展具有重要意义。真菌是一类种类繁多、分布广泛的真核微生物,真菌构成了土壤的大部分微生物生物量,具有分解有机质,为植物提供养分的功能,是生态系统健康的指示物,真菌多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供大量未开发的生物资源方面起到了重要作用。因此,研究东祁连山高寒草地土壤真菌的种类、数量组成和生态分布等,并对该区的真菌群落进行多样性比较与分析,旨在揭示该区域草地土壤环境中真菌群落的基本特征、分布状况及物种多样性等,以期为东祁连山高寒草地的有效保护和综合开发提供依据。本文选取东祁连山七类具有代表性的高寒草地植被类型作为试验样地,即杜鹃灌丛(Rhododendron fruticosa shrub land),高山柳灌丛(Salix cupularis fruticosa shrub land),金露梅灌丛(Dasiphoru fruticosa shrub land),珠芽蓼草地(Polygonum grassland),禾草草地(Grass grassland),沼泽草地(Swamp grassland)和嵩草草地(Kobresia grassland)。选用PDA培养基、PSA培养基、玉米粉琼脂培养基和马丁氏-孟加拉红培养基分离土壤真菌;对土壤中的真菌采用表型鉴定和基于ITS rDNA基因序列的系统发育分析鉴定;并根据鉴定的土壤真菌和各测度指数的特点及取样数据的类型,应用生态学评价方法对可培养真菌多样性进行分析;把DGGE和Nested PCR运用到东祁连山高寒草地土壤微生物多样性的研究中;对土壤中的优势真菌——被孢霉,选择其中的具有代表性的3个高山被孢霉株进行了生物学特性研究。主要研究成果如下:1对不同培养条件下土壤真菌的分离数量进行测定分析可知,同一样品在不同pH、温度和培养基下培养后,分离出的菌群种类和数量都差异较大,马丁培养基较PDA、PSA和玉米粉培养基测得的数量、种类较多,相对适合土壤真菌的分离培养。通过比较采用的几种培养方案,真菌的最适分离温度为20℃,最适分离pH值为6.5,最适分离培养基为马丁氏培养基。2对分离的可培养土壤优势真菌应用表型鉴定和ITS rDNA序列分析进行分类,通过大规模的分离培养方法,综合表型鉴定和序列分析结果可以得出,东祁连山高寒草地土壤中主要的可培养真菌为:被孢霉属(Mortierella spp.)、柔束霉属(Doratomyces spp.)、小球腔菌属(Leptosphaeria spp.)、枝孢属(Cladosporium spp.)、轮枝菌属(Verticillium spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、弯颈霉属(Tolypocladium spp.)、白僵菌属(Beauveria spp.)、肉座菌属(Hypocrea spp.)、截盘多毛孢属(Truncatella spp.)、虫草属(Cordyceps spp.)、木霉属(Trichoderma spp.)、丛赤壳属(Nectria spp.)、亚隔孢壳属(Didymella spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、生赤壳属(Bionectria spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、地丝菌属(Geomyces spp.)、镰孢菌属(Fusarium spp.)、帚霉属(Scopulariopsis spp.)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria spp.),鉴定所得菌株可分属于22个属,绝大多数属于半知菌亚门和接合菌亚门真菌。另外,有大于10%的分离菌种暂时无法确定其分类地位,极可能是新种。3本试验也对可培养土壤真菌的多样性及群落生态特征进行了研究,结果表明,物种的丰富度(S)、Shannon- Wiener多样性指数(H)、Simpson优势度(D)和Pielou均匀度指数(J)变化范围分别为15～18,2.47～2.81,0.89～0.93,0.91～0.97;各指数在各类型草地中波动较为平缓,反映出基本一致的变化趋势,多样性指数的大小顺序为:嵩草草地>珠芽蓼草地>金露梅灌丛>高山柳灌丛>禾草草地>杜鹃灌丛>沼泽草地,除Pielou指数外其他指数均以嵩草草地较高,沼泽草地较低;东祁连山高寒草地土壤多样性较丰富,其多样性和草地类型的特异性有着密切的关系。4四不同草地土壤真菌的DGGE分析研究,采用Nested-PCR技术扩增土壤真菌ITS1 rDNA区域,利用该产物优化土壤真菌DGGE条件,应用DGGE图谱分析技术,并结合切胶测序及系统发育分析对土壤真菌菌群结构进行研究。结果表明Nested-PCR其具有较高的灵敏性,可有效的从微量DNA中扩增出约250 bp的ITS1 rDNA目的片段。DGGE条带测序及图谱分析表明,4种类型草地土壤DGGE带谱在条带的数量和亮度方面均存在较大差异,和可培养真菌的变化趋势基本一致。5三个高山被孢霉菌株的生物学特性的研究表明它们之间差异显著,M. ap27、M.ap60和M.ap9的最适氮源均为蛋白胨,M.ap27的最适碳源为淀粉,M.ap60的最适碳源为蔗糖,M.ap9的最适碳源为葡萄糖;3个高山被孢霉菌株在5～30℃的温度处理下都能生长,M.ap27的最适生长温度为30℃,M.ap60和M.ap9的最适生长温度均为5℃;3个高山被孢霉菌株在pH值4～9范围内均能生长,适宜pH值为7。

全文目录

缩写词  2-3
摘要  3-5
Summary  5-11
第一章绪论  11-27
  引言  11
  文献回顾  11
  1 土壤微生物学的发展简史  11-13
  2 土壤微生物在生态系统中的作用  13-15
    2.1 固定氮素  13
    2.2 释放难溶矿质中的营养元素  13
    2.3 提高植物的抗逆性  13-14
    2.4 降解污染物，减少毒性  14
    2.5 促进腐质酸的形成  14
    2.6 产生植物激素  14-15
    2.7 提供物理屏障，减少病原菌侵害  15
  3 土壤微生物生态学研究方法进展  15-18
    3.1 微生物纯培养  15-16
    3.2 土壤酶  16
    3.3 土壤微生物量  16
    3.4 生物标记物  16-17
    3.5 分子生物学技术  17-18
  4 土壤微生物多样性研究进展  18-24
    4.1 草地土壤微生物的研究进展  19-20
    4.2 土壤微生物多样性的研究状况  20-22
    4.3 土壤真菌多样性方法的研究进展  22-24
  5 研究意义  24-25
  6 研究内容和技术路线  25-27
第二章土壤真菌培养条件的初探  27-33
  1 前言  27
  2 材料与方法  27-29
    2.1 区域概况  27
    2.2 样点的选择与样品的采集  27-28
    2.3 培养基的种类  28-29
    2.4 分离培养方法  29
    2.5 计数方法  29
    2.6 数据统计分析  29
  3 结果与分析  29-31
    3.1 不同温度下分离土壤真菌的数量  29-30
    3.2 不同pH 值下分离土壤真菌的数量  30
    3.3 不同培养基分离土壤真菌的数量  30-31
  4 结论与讨论  31-33
第三章土壤真菌的表型鉴定及ITS rDNA 鉴定  33-50
  1 前言  33
  2 材料与方法  33-37
    2.1 待鉴定菌株  33
    2.2 土壤真菌的形态鉴定  33-34
    2.3 土壤真菌的ITS rDNA 序列分析  34-37
      2.3.1 菌丝体的培养收集  34
      2.3.2 基因组DNA 的提取  34-35
      2.3.3 DNA 纯度的检测  35
      2.3.4 扩增引物  35-36
      2.3.5 PCR 扩增  36
      2.3.6 PCR 扩增产物的电泳检测及纯化  36
      2.3.7 ITS rDNA 序列的测定  36
      2.3.8 ITS rDNA 序列分析  36-37
  3 结果与分析  37-48
    3.1 部分土壤真菌的形态描述  37-39
    3.2 提取DNA 方法的比较  39
    3.3 PCR 扩增的目的片断  39-40
    3.4 ITS rDNA 的系统发育树的构建及分析  40-48
  4 讨论与结论  48-50
第四章东祁连山高寒草地可培养土壤真菌的物种多样性分析  50-55
  1 前言  50
  2 材料与方法  50-51
  3 结果与分析  51-53
  4 结论与讨论  53-55
第五章土壤样品宏基因组DNA 的提取及IT51 rDNA 序列的DGGE 分析  55-64
  1 引言  55
  2 材料和方法  55-59
    2.1 试剂与仪器  55-56
    2.2 基质样品的采集  56
    2.3 基质DNA 提取  56
    2.4 PCR 扩增  56-57
    2.5 DGGE 步骤  57-58
    2.6 胶板条带的后处理  58-59
  3 结果与分析  59-62
    3.1 基质微生物DNA 的提取  59
    3.2 PCR-DGGE 结果  59-62
  4 结论与讨论  62-64
第六章优势真菌被孢霉的生物学特性的研究  64-69
  1 前言  64
  2 材料与方法  64-65
    2.1 菌种来源  64
    2.2 供试培养基  64-65
    2.3 方法  65
  3 结果与分析  65-67
    3.1 菌丝对多种碳源、氮源的利用情况  65-66
    3.2 温度对菌丝生长的影响  66-67
    3.3 pH 对菌丝生长的影响  67
  4 结论与讨论  67-69
第七章结论与展望  69-72
  1 结论  69-70
  2 展望  70-72
参考文献  72-84
附录  84-102
  1 ITS rDNA 基因序列在GenBank 中的登录号及其提交的序列  84-100
  2 部分真菌的培养形态和显微形态  100-102
个人简介  102-103
导师简介  103-105
致谢  105

东祁连山高寒草地土壤真菌多样性研究

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