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人GRP78 miRNA载体的构建及其对EC109细胞增殖的影响
作 者: 李洪标
导 师: 吴灵飞
学 校: 汕头大学
专 业: 消化内科
关键词: GRP78 miRNA EC109细胞 HEK293细胞 细胞增殖
分类号: R735.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
研究目的:构建人GRP78 miRNA表达载体,筛选出最佳干扰效果的干扰载体,转染EC109细胞,探讨其对EC109细胞增殖的影响。材料和方法:1、根据miRNA干扰原理,设计合成4对针对人GRP78的特异性miRNA干扰序列,连接到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR表达载体,分别命名为miR78-1、miR78-2、miR78-3、miR78-4,并通过测序鉴定。2、把测序正确的干扰质粒利用脂质体Lipofectamine 2000转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况以检测转染效率,通过杀稻瘟菌素筛选2周左右,得到稳定表达干扰质粒的细胞株,通过RT-PCR检测稳定筛选后HEK293细胞中GRP78 mRNA的表达水平。3、将最佳干扰效果的干扰质粒瞬时转染EC109细胞,通过RT-PCR检测转染24h后GRP78 mRNA的表达水平,利用CCK8检测转染干扰质粒0h、12h、24h、48h、72 h后EC109细胞的增殖情况。结果:1、DNA测序表明重组质粒中含有目的片段,且插入片段的碱基序列完整,没有碱基的突变以及丢失。2、建立了稳定表达干扰质粒的HEK293细胞株,稳定转染后HEK293细胞在荧光显微镜下观察均有绿色荧光蛋白表达。与阴性对照组、未转染组比较,在干扰组细胞中GRP78 mRNA的表达有不同程度的下降(P<0.05),其中转染miR78-1组GRP78 mRNA的表达下降最明显(P<0.05)。3、miR78-1干扰质粒瞬时转染EC109细胞后,与未转染组、阴性对照组相比,细胞中GRP78 mRNA的表达下降(P<0.05);CCK8检测结果表明转染miR78-1干扰质粒12, 24, 48, 72 h后,EC109细胞的增殖减慢(P<0.05)。结论:1、设计的4对干扰序列正确完整地克隆到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中,GRP78 miRNA表达载体构建成功。2、成功建立了GRP78基因“敲弱”的HEK293细胞模型,筛选出miR78-1为最佳干扰效果的干扰载体。3、miR78-1干扰质粒瞬时转染EC109细胞后,能抑制EC109细胞中GRP78 mRNA的表达,能抑制EC109细胞的生长。
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全文目录
中文摘要 4-6 英文摘要 6-8 缩略词简表 8-11 前言 11-13 1.1 研究背景 11-12 1.2 本研究课题的基金来源 12-13 第一部分 人GRP78 miRNA 载体的构建及筛选鉴定 13-29 第一章 材料与方法 13-24 1.1 实验材料 13-15 1.2 实验方法 15-24 第二章 结果与分析 24-27 2.1 干扰质粒测序结果 24 2.2 荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP 的表达情况 24-25 2.3 稳定转染细胞中GRP78 mRNA 的表达情况 25-27 第三章 讨论 27-29 第二部分 人GRP78 miRNA 载体对EC109 细胞增殖的影响 29-44 第一章 材料与方法 29-38 1.1 实验材料 29-30 1.2 实验方法 30-38 第二章 结果及分析 38-41 2.1 EGFP 的表达情况 38 2.2 GRP78 mRNA 表达水平改变 38 2.3 CCK8 检测转染细胞增殖变化 38-41 第三章 讨论 41-44 结论 44-45 参考文献 45-49 综述 49-58 参考文献 54-58 附录(试剂配制) 58-59 致谢 59-60 个人简介 60
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 食管肿瘤
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