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JMJD5催化单甲基化组蛋白H3氨基末端水解

作　者: 相学平
导　师: 秦樾；邵吉民
学　校: 浙江大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: JMJD5 组蛋白甲基化组蛋白水解基因表达调控
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

组蛋白H3氨基末端区域呈柔性游离状态,末端的侧链能被核内不同的酶甲基化、乙酰化以及磷酸化。通过这些氨基末端侧链的翻译后修饰,使得组蛋白能够调控染色质的折叠进而调控基因的表达。目前为止,氨基末端主要位点的翻译后修饰均已找到其对应的酶来移除。H3氨基端的修饰同样也包括其残基的肽键被水解而切割。新的证据表明H3氨基末端水解切割不同于H3蛋白的替换,也是受酶活性作用的调节。最近,组蛋白氨基末端的水解切割被证明在哺乳动物和酵母的分化过程中对基因的表达调控起着重要的作用。H3氨基末端被切割后将侧链上的修饰连同整个肽段被移除,从而产生一个新的更短的残基,它是应对环境改变的一种翻译后修饰之一。像营养缺失等细胞应激条件会通过触发以上的修饰,比如水解切割等来影响组蛋白H3氨基末端的活性。然而,在细胞核内对H3氨基末端进行水解切割的酶却仍然未知。在染色质中,组蛋白氨基端残基能被多种翻译后修饰调控,包括甲基化、乙酰化、磷酸化以及蛋白水解切割。然而,组蛋白氨基端残基的水解切割机制却还没有研究清楚。在本文中,首先我们利用生物信息学结构分析,发现JMJD5这种只含有Jumonji C (JmjC)结构域的蛋白具有比传统含JmjC域的组蛋白去甲基酶更长的氨基末端,且其二级结构与Cathepsin L具有很大的相似性。通过多种方法,我们证明了JMJD5蛋白是一种新型的组蛋白水解酶,负责对组蛋白H3的氨基末端进行水解切割,进而可能调控基因的转录。其次,我们利用体外反应法和细胞内实验进一步对JMJD5的催化特性进行研究,发现JMJD5在H3单甲基化赖氨酸位点的羧基端进行切割,形成一个较短的氨基末端,从而移除一部分表观遗传标志。体外H3肽段水解试验结果显示JMJD5唯独切割单甲基化(mMK)的H3肽段,而对二甲基化(dMK)、三甲基化(dMK)以及无甲基化(uMK)的H3肽段没有或几乎没有水解切割作用。最后,为了研究JMJD5蛋白的结构特征,我们构建并表达了JMJD5蛋白的截断体和突变体,发现JMJD5的JmjC结构域使JMJD5蛋白自身二聚化并具有结合组蛋白H3氨基端的功能,此外,JMJD5蛋白的氨基端结构却对整个蛋白的活性有一定的抑制作用。于此同时,实验室其他成员利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对部分组蛋白甲基化依赖的基因进行检测,发现在细胞内全长的JMJD5过表达能抑制这些基因的转录,而仅仅过表达JMJD5的氨基端结构却一定程度上缓解了细胞内源性JMJD5对这些基因转录的抑制作用,进一步证明了JMJD5氨基端结构是一段负性调控的区域。有趣的是,在本实验室经典研究模型MNNG刺激下,不仅细胞中错配修复基因表达明显上调,JMJD5基因的表达也随之迅速上调,单独过表达JMJD5蛋白也能引起这些错配修复基因的表达上调,而过表达JMJD5或使用SiRNA抑制JMJD5表达分别能缓解和增强MNNG引起的细胞周期阻滞效应。之前JMJD5被报道具有对H3K36me2去甲基化的功能,以上现象提示了JMJD5在MNNG诱导下,可能通过移除错配修复基因表达区的抑制性组蛋白甲基化修饰(H3K36me)从而促进这些错配修复基因的转录。综上所述,在哺乳动物中,JMJD5能通过切割单甲基化的组蛋白赖氨酸位点,将氨基端残基上的表观遗传标志整个删除,进而可能调节H3氨基端依赖的基因表达。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-10
缩略语  10-11
目次  11-13
1 引言  13-17
2 实验材料与方法  17-25
  2.1 实验材料  17-19
    2.1.1 抗体  17
    2.1.2 肽段  17
    2.1.3 Cathepsin L特异性抑制剂  17
    2.1.4 细胞转染试剂  17
    2.1.5 融合蛋白纯化试剂  17-18
    2.1.6 细胞培养试剂  18
    2.1.7 分子克隆及荧光定量PCR试剂  18
    2.1.8 SiRNA及PCR引物  18
    2.1.9 细胞系  18
    2.1.10 体外反应试剂  18-19
    2.1.11 细胞蛋白提取相关试剂  19
  2.2 实验方法  19-25
    2.2.1 原核蛋白表达纯化  19-21
    2.2.2 酸抽提法提取组蛋白  21
    2.2.3 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)  21
    2.2.4 细胞培养、细胞转染、SiRNA干扰、MNNG处理细胞  21-22
    2.2.5 GST Pull-dwon、免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation)  22
    2.2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)  22-24
    2.2.7 流式细胞仪检测细胞周期  24
    2.2.8 体外水解反应  24-25
3 结果与讨论  25-50
  3.1 结果  25-47
    3.1.1 Hela与A549细胞中JMJD5过表达引起组蛋白H3氨基端水解增强  25-30
    3.1.2 JMJD5与Cathepsin L二级结构相似  30
    3.1.3 体外重组His-JMJD5蛋白催化单甲基化组蛋白H3水解  30-37
    3.1.4 JMJD5蛋白与组蛋白H3氨基末端相互作用  37-41
    3.1.5 JMJD5氨基端区域负性调控自身酶活性  41
    3.1.6 SiRNA干扰细胞内源JMJD5表达能减弱H3水解  41-42
    3.1.7 细胞内JMJD5以及Cathepsin L诱导的H3水解都能被E-64抑制  42-43
    3.1.8 JMJD5参与化学致癌物MNNG引起的细胞反应  43-45
    3.1.9 JMJDS影响MNNG引起的细胞周期阻滞现象  45-47
  3.2 讨论  47-50
4 结论和展望  50-52
  4.1 主要结论  50
  4.2 展望  50-52
参考文献  52-53
综述  53-64
  参考文献  60-64
作者简历及在学期间取得的科研成果  64

JMJD5催化单甲基化组蛋白H3氨基末端水解

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