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IVM对小鼠卵母细胞ESET和H3K9Me3表达影响研究

作　者: 刘素晓
导　师: 金帆
学　校: 浙江大学
专　业: 妇产科学
关键词: IVM MⅡ卵母细胞组蛋白甲基化 ESET H3K9Me3 表观遗传学重新编程
分类号: R714.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

背景哺乳动物卵母细胞的体外培养成熟(in-vitro maturation,IVM)联合体外受精(in-vitro fertilization,IVF)和体外胚胎培养(in-vitro embryo culture,IVC)技术已被广泛应用于基础研究及人类不育的临床治疗。IVM技术是指直接从卵巢中取得未成熟卵母细胞,在体外培养至第二次减数分裂中期(metaphaseⅡstage of meiosis,MⅡ)。卵母细胞IVM应用于临床有以下几个重要原因:(1)可以避免卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS);(2)IVM联合卵巢或卵母细胞冷冻技术可以为接受癌症化疗的妇女提供妊娠机会;(3)可以解决目前临床上诱导排卵方案存在的许多问题,如高昂的医疗费用以及激素刺激所带来的副反应。基于上述优点,IVM技术较传统的体外受精(IVF)技术容易被患者接受。许多不育机构尝试运用IVM技术治疗病人,但是IVM的成功率明显低于IVF。在卵子形成过程中,卵母细胞与其周围的体细胞存在着交互对话。诸如营养物质、激素的变化以及环境混合物等因素均可对卵子的质量和后续的胚胎生长产生重大的影响。体外培养成熟组的卵母细胞是在模拟体内的微环境中发育,由于缺乏体内完善的自我调控系统,模拟环境的稳定性不及体内;其次,培养过程中的体外操作步骤不可避免地将卵母细胞暴露于变化的环境中,如室温、可见光光线等;它们有可能对卵母细胞发育造成影响。基因组DNA及其表观遗传学修饰等众多的分子生物学机制共同调控哺乳动物的生长。在哺乳动物的生殖、发育或疾病的某些特殊时期,细胞会通过染色质DNA甲基化水平改变,组蛋白尾部修饰,非组蛋白的结合,染色质重塑,有序地调整基因表达,其过程不涉及DNA碱基序列改变,称为表遗传修饰重新编程。表遗传标志是可以通过有丝分裂和减数分裂遗传的。基因激活/失活的精确时间点对正常的植入前胚胎发育至关重要,任何表达的延迟或缺失都会导致异常。因此,重新编程需获得激活的正确时间点和基因表达的完好的排列方式,以启动和继续受精之后的胚胎发育。卵子有效阻止多精受精的能力明显地受成熟度的影响。卵母细胞具有重组进入其内精子染色体的功能,使之转变为雄原核(pronucleus,PN),并参与全部染色体甲基化和乙酰化的表遗传重组过程。体外培养成熟的卵母细胞易出现纺锤体和染色体的异常,表观遗传重新编程能力的下降,这些异常可能与受精率低有关。染色质的基本单位为核小体,核小体由四种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)各两分子构成的八聚体和缠绕其上的DNA所构成。组蛋白翻译完成后,其氨基尾巴会发生多种共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化等,这些修饰方式共同构成了“组蛋白密码”。核心组蛋白的修饰影响染色质的结构和功能。在基因沉默相关的各种组蛋白修饰中,最典型的是组蛋白去乙酰化和甲基化。甲基化是组蛋白各种修饰中最复杂的修饰方式,甲基位点可以是赖氨酸(lysine,K)残基和精氨酸(argine,Arg)残基,与转录激活和抑制都相关。H3K9的甲基化可招募HP1(heterochromatin proteins)或其同源物与之结合,从而使基因所在部位异染色质化,这表明,组蛋白的甲基化可能与异染色质的形成有关,并且调控着个别基因的表达。H3K9Me3(histone H3lysine 9 tri-methylation)参与异染色质的形成和维持,使基因表达沉默。组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶(histone methyltransferases,HMTs)完成的。基因活性启动子募集H3K9Me3特异甲基化转移酶导致异染色质的形成和转录抑制。ESET(ERG-associated protein with SET domain)是一种组蛋白H3K9三甲基转移酶,它通过特异性三甲基化组蛋白H3K9,行使转录调控和随后的局部染色质修饰的功能,进而导致基因沉默并参与异染色质的维持。作为一种组蛋白甲基转移酶(HMT),ESET可能与调控基因转录的其他染色质重塑酶组成复合物。ESET/SETDB1是催化H3K9Me3的唯一常染色质HMT。众多研究表明,体外操作的各个环节及培养环境均可能影响卵母细胞的生长发育,影响表观遗传重新编程。组蛋白修饰参与染色体类型的转变,调节卵母细胞的生长发育。H3K9Me3和ESET在卵母细胞的表观遗传重新编程,卵母细胞形成过程中基因转录及成熟后的受精中都有重要作用。通过对IVM卵母细胞的研究,可以揭示外部因素对卵母细胞生长发育的影响、组蛋白修饰、表观遗传重新编程的作用并为IVM技术的安全性提供理论支持。但是至今还未见关于IVM卵母细胞H3K9Me3和ESET表达的研究。因此,我们采用机械方法获取小鼠GV期卵母细胞,在体外培养成熟,测量IVM卵母细胞的直径,通过RT-PCR方法检测ESET基因mRNA水平,免疫荧光细胞化学方法检测IVM卵母细胞ESET和H3K9Me3蛋白表达,并与体内成熟组进行比较。研究目的观察小鼠经体外培养成熟的卵母细胞的体积、ESET基因mRNA水平、ESET和H3K9Me3蛋白表达,比较它们在IVM卵母细胞与体内成熟的卵母细胞之间的差异,探讨外部因素对卵母细胞生长发育和组蛋白修饰的作用并为IVM技术的安全性提供理论支持。材料方法1.实验动物ICR品系雌性小鼠2.实验分组2.1 IVM组ICR品系雌性小鼠经孕马血清促性腺激素(pregnant mareserum gonadotropin,PMSG)超促排卵46～48h后,颈椎脱臼法处死,采用针剥法撕破双侧卵巢取GV期卵母细胞。在MHTF中漂洗一遍,转移至含有激素(rFSH0.075IU/ml,hCG 0.5IU/ml)的HTF培养基中进行培养。培养14～16h后,从培养系统中收集成熟卵母细胞(MⅡ期)。2.2体内组ICR品系雌性小鼠经PMSG超促排卵46～48h后,注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG),注射HCG后13～15h颈椎法脱臼法处死。用注射器刺破输卵管膨大部,获取卵母细胞-放射冠-卵丘细胞复合物(oocyte-conora-cumulus complexes,OCCs),透明质酸酶消化颗粒细胞5～10min,获取MⅡ期裸卵。3.利用MacBiophotonics Image J软件测量卵母细胞直径。4.以18S RNA为参照,RT-PCR扩增两组卵母细胞ESET的mRNA,利用KODAK EDAS 290凝胶成像系统软件比较两组中ESET的mRNA的相对表达量。5.荧光免疫细胞化学法同时检测ESET和H3K9Me3的蛋白的分布,并应用激光共聚焦扫描显微镜(ZEISS LSM510)成像系统的附带软件对ESET和H3K9Me3荧光灰度值进行差异比较。6.统计学分析计算卵母细胞ESETmRNA/18S RNA比值及ESET和H3K9Me3荧光灰度值,应用SPSS16.0统计软件包,行Independent-sample T Test检验分析,P＜0.05为有显著性差异。结果1.IVM卵母细胞的发育GV期卵母细胞在体外培养14～16h后,成熟率为78.61%。实验中选取的IVM卵母细胞,直径平均为(75.03±2.98)um,体内成熟的卵母细胞,直径平均为(95.77±4.03)um(p＜0.01)。2.RT-PCR结果ESET mRNA相对表达量在两组间无显著性差异(P＞0.05)。3.细胞免疫荧光结果3.1无论在IVM组还是在体内组,MⅡ期卵母细胞均有明显的ESET蛋白表达。表达分布特点均为:卵母细胞胞浆内的均匀表达,卵母细胞周边皮质区的表达增强。卵母细胞ESET蛋白免疫荧光染色强度灰度值比较发现IVM组显著低于体内组(P=0.007)。3.2 H3K9Me3蛋白在MⅡ期卵母细胞表达模式在两组间无差异,均与DAPI的位置重合,存在于卵母细胞和极体的染色体上。极体染色体的荧光强度显著高于卵母细胞染色体的荧光强度(P＞0.05)。结论1.IVM过程影响卵母细胞的生长发育,IVM卵母细胞的直径小于体内成熟组的。2.ESET蛋白在MⅡ期卵母细胞表达,表达分布特点均为:卵母细胞胞浆内的均匀表达,卵母细胞周边皮质区的表达增强。IVM过程虽未影响ESET基因的转录,却能影响ESET蛋白质的表达量。3.甲基化的H3K9—H3K9Me3只表达于MⅡ期卵母细胞的染色质/染色体和第一极体上,IVM对其表达水平无明显影响。4.IVM下调卵母细胞ESET蛋白表达,但对其效应物H3K9Me3表达无明显影响,可能与二者在MⅡ期卵母细胞分布位置不同相关。提示位于MⅡ期卵母细胞胞浆内ESET主要功能为母源性储备,IVM过程对ESET表达影响的效应应该在受精和卵裂胚胎中呈现。

全文目录

英文缩略语  3-5
中文摘要  5-11
英文摘要  11-18
正文  18-48
  前言  18-22
  材料和方法  22-30
  结果  30-37
  讨论  37-41
  结论  41-42
  参考文献  42-48
综述  48-57
致谢  57

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